[发明专利]辅酶结合型葡萄糖脱氢酶及编码该酶的多核苷酸

说明书

技术领域

本发明涉及新型的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(以下有时记为“GLD”)、编码该酶的多核苷酸、其获取方法、该GLD的制备方法、及此GLD的应用。

背景技术

血中葡萄糖量是糖尿病的重要标志。糖尿病的检查，除在医院检查室等中进行的临床检查之外，还可以进行由诊断人员等进行的简易检查或由患者自己进行的自检查等简易测定(Point-of-Care Testing：POCT)。

此简易测定可以通过葡萄糖诊断试剂盒或生物传感器等测定装置(POCT装置)进行，目前，上述POCT装置中开始使用葡萄糖氧化酶。但是，葡萄糖氧化酶受溶存氧浓度的影响，使测量值产生误差，因此，推荐使用不受氧影响的葡萄糖脱氢酶。

葡萄糖脱氢酶包括以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)为辅酶的NAD辅酶非结合型葡萄糖脱氢酶、和以吡咯喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等为辅酶的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，辅酶结合型葡萄糖脱氢酶与NAD辅酶非结合型葡萄糖脱氢酶相比，不易受杂质的影响，测定感度高，并且从原理上看具有可以廉价地制备POCT装置的优点。

但是，现有的吡咯喹啉醌(PQQ)型葡萄糖脱氢酶具有稳定性低、并且也与麦芽糖或半乳糖反应的缺点。麦芽糖是用于输液的糖，如果PQQ葡萄糖脱氢酶与麦芽糖反应，则血糖POCT装置显示比实际高的血糖值。因此，导致患者进行了不必要的胰岛素注射，结果发生陷入意识障碍或昏睡状态等低血糖事故，造成严重问题。

特别指出的是，现在的血糖POCT装置的应用主要是简单地测定血糖，进而由于作为患者自我管理及治疗的一种方法的重要性提高，因此使用的自我监测血糖装置(Self-Monitoring of Blood Glucose：SMBG)向家庭中的普及迅速扩大，所以对测定精度的要求非常高。

目前，2005年2月日本卫生劳动部发出通知，要求对正注射麦芽糖输液的患者使用利用了以PQQ作为辅酶的酶的血糖测定器时，加以注意(2005年2月7日；药食安发第0207005号等)。

另一方面，作为催化葡萄糖脱氢反应、以FAD为辅酶的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，已报道有来自根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(J.Biol.Chem.(1967)242：3665-3672)、来自海黄噬纤维菌(Cytophaga marinoflava)(Appl.Biochem.Biotechnol.(1996)56：301-310)、来自盐单胞菌α-15(Halomonas sp.)(EnzymeMicrob.Technol.(1998)22：269-274)、来自双孢蘑菇(Agaricusbisporus)(Arch.Microbiol.(1997)167：119-125、Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)51：58-64)及来自大环柄菇(Macrolepiotarhacodes)(Arch.Microbiol.(2001)176：178-186)的酶，但是，上述酶氧化葡萄糖的2位及/或3位的羟基，对麦芽糖的活性都很高，对葡萄糖的选择性低。另外，也已知同样对麦芽糖活性高、来自洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，该酶的天然型酶是由α、β、γ3种亚基构成的杂寡聚物酶，为膜结合性酶。所以存在以下问题：为了得到酶，必须进行可溶化处理，或者为了在克隆中呈现充分的活性必须同时克隆必要的亚基等。

并且，根据日本生物工学会大会(2002年10月28日-30日)的报告，基质特异性(对葡萄糖活性为100％时，对麦芽糖的活性、对半乳糖的活性)为SM4株40％、105％、JCM5506株43％、132％、JCM550株57％、123％、JCM2800株83％、108％、JCM2801株74％、117％、IFO14595株38％、104％、IFO15124株74％、148％，据报告者所述，由于对麦芽糖的活性高，用于自我血糖监测器时存在问题，期望今后能改变序列，改良基质特异性。

针对上述问题，本发明人等发明了一种以FAD为辅酶的、非膜结合型的新型可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，并申请了专利(专利文献1)。此专利文献1的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶具有迄今为止没有的优异特性，即氧化葡萄糖的1位羟基，对葡萄糖的基质识别性优异，不受溶存酶的影响，并且对麦芽糖的活性低(对葡萄糖活性为100％时，对麦芽糖活性为5％以下、对半乳糖活性也为5％以下)。