[发明专利]胚胎干细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及培养多潜能细胞以促进细胞受控的自我更新的方法。本发 明进一步提供从多潜能细胞扩增和分化均一的细胞群体的集成方法。此外， 本发明提供筛选方法以识别影响多潜能细胞，如胚胎干细胞生长和分化的 条件、培养基和刺激因素。

背景技术

术语“干细胞”描述的是能够形成多种组织类型细胞的细胞。存在不同类 型的干细胞。当精子使卵受精时，形成单个全能细胞，这个全能细胞具有 形成整个生物体的能力。在受精后的第一个小时，这一细胞分裂为完全相 同的全能细胞。受精后大约四天并经过几个周期的细胞分裂之后，这些全 能干细胞开始特化。当全能细胞变得更加特化时，它们随之被称为“多潜能 的(pluripotent)”。多潜能细胞能够分化为身体中的每种细胞类型，但是不 能形成胎盘或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潜能干细胞的分化潜能 不是“全体”的，因此不将这种细胞称为“全能”，而且它们不是胚胎。多潜 能干细胞进一步特化为多能(multipotent)干细胞，其专用于分化为为特定 功能特化的特定种系的细胞。多能细胞能够分化为它们所源自的组织中含 有的细胞类型；例如血液干细胞只能够分化为红血细胞、白血细胞和血小 板。

多潜能干细胞，如胚胎干(ES)细胞、胚胎生殖干(EG)细胞以及多 能干细胞，如脐带干细胞和成人干细胞因其自我更新的能力和可塑性能力 而是被提议为用于组织工程的有力工具。多潜能干细胞，如胚胎干细胞， 能够在体外被诱导分化为中胚层、外胚层和内胚层细胞谱系的多能细胞。 中胚层谱系的细胞，如成骨细胞、软骨细胞和心肌细胞分别在形成骨的、 成软骨和成肌补充物的影响下产生。现在，多潜能干细胞，如胚胎干细胞 和多能细胞的医药用途受限于缺少关于组织样结构形成的知识和自发分化 为不同细胞谱系的倾向；甚至这种多谱系潜能可以表现为形成异位组织的 风险。对于临床应用，高纯度的均一细胞群体可能是必需的。

为有效的使用多潜能细胞进行临床治疗，首要的是提供足够数量的用 于相关临床应用的细胞。未分化的胚胎干细胞是产生关键分化细胞类型的 有希望的来源；但是对于许多未分化细胞群体，现有的培养方法或者不适 合扩增，或者不能提供有效产量的分化细胞。

现有的维持人胚胎干(hES)细胞的方法需要使用饲养层、饲养条件培 养基(feeder-conditioned media)或在培养基中供应人或动物细胞提取物以 扩增人胚胎干细胞和防止自发分化。如计划在随后将细胞用于人类治疗， 该方法是不适合的。人胚胎干细胞的临床应用需要在标准化的、受良好控 制的无动物产品的环境(因此被称为“无外源物(xeno-free)”的培养环境， 其降低传输疾病的风险)中培养细胞的方法。此外，需要在不存在饲养层 或支持细胞的情况下培养人胚胎干细胞的方法以降低饲养细胞或源自饲养 细胞的污染物污染人胚胎干细胞治疗产品的风险。理论上，生产足够数量 的人胚胎干细胞的方法应该是标准化的和可调控的。至今还没有这样的方 法，并且使用传统方法分离和维持人胚胎干细胞是非常需要技术的过程， 不适于临床应用(1)。因此需要开发改良的培养方法以用于扩增和在需要 时接着分化人胚胎干细胞。

转变未分化的鼠胚胎干细胞(mES)为更分化的细胞类型的方法是已知 的。但是，使用已有的二维平板或培养瓶(flask)培养方案，该过程是分 段的，涉及高维持费用，对样本具有破坏性并且结果非常易变。

传统上，在二维培养物中胚胎干细胞培养方案涉及三个截然不同的阶 段，首先胚胎干细胞维持(即自我更新，也称为扩增，以形成干细胞集落)， 然后是导致胚状体(EB)形成的初始分化，随后是进一步的谱系特异性分 化。每个阶段都需要熟练的操作和阶段特定的方案。

对于胚胎干细胞维持，最初是分离胚胎干细胞细胞，然后在饲养层上 进行共培养。随后发现可使用条件培养基替代饲养层(2；3)，并且对于鼠胚 胎干细胞，当以纯化形式供应LIF(由饲养细胞分泌的营养因子)时，其能 够维持多潜能性(4)。