[发明专利]胚胎干细胞培养方法

权利要求书

1.细胞培养的方法，其包括：

(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干(ES)细胞以形成支持基质结构， 和，

(b)通过在维持培养基中维持被包裹在三维培养物中的细胞而维持培 养。

2.权利要求1的方法，其中维持培养在没有饲养细胞和没有饲养细胞 条件培养基的情况下进行。

3.权利要求1或权利要求2的方法，进一步包括在适合细胞分化的条件 下在分化培养基中分化包裹在三维培养物中的细胞。

4.权利要求3的方法，其中所述维持和分化阶段在同一容器中进行。

5.权利要求3或权利要求4的方法，其中提供对分化的刺激。

6.权利要求5的方法，其中对分化的刺激包括对胚状体形成的刺激。

7.权利要求6的方法，其中对胚状体形成的刺激是消除或减少与抑制 分化的物质的接触；和/或添加或增加与促进胚状体形成的物质的接触。

8.权利要求3至7任一项的方法，其中提供分化为外胚层、内胚层或 中胚层谱系的刺激。

9.权利要求3至7任一项的方法，其中提供分化为中胚层骨骼谱系的 刺激。

10.权利要求3至7任一项的方法，其中提供对骨形成分化或软骨形成 分化的刺激。

11.细胞培养的方法，包括：

(a)提供包裹在支持基质中的单个胚胎干细胞或多个胚胎干细胞以形 成支持基质结构，

(b)在适合胚胎干细胞维持的条件下通过在维持培养基中维持在三维 培养物中包裹的一个或多个细胞而维持培养，

(c)在适合骨形成分化的条件下通过在分化培养基中分化在三维培养 物中的被包裹的细胞而进行骨形成分化。

12.权利要求11的方法，其中所述被包裹的细胞的骨形成分化包括：

(i)在分化培养基中温育在三维培养物中被包裹的胚胎干细胞，并提供 对胚状体形成的刺激，然后，

(ii)在分化培养基中温育(i)中产生的被包裹的细胞，并提供对骨形成分 化的刺激。

13.权利要求11的方法，其中所述被包裹的细胞的骨形成分化包括：

(i)在分化培养基中温育在三维培养物中的被包裹的胚胎干细胞，然后，

(ii)在分化培养基中温育(i)中产生的被包裹的细胞，并提供对骨形成分 化的刺激。

14.权利要求11的方法，其中所述被包裹的细胞的骨形成分化包括：在 分化培养基中温育被包裹的胚胎干细胞，并提供对骨形成分化的刺激。

15.权利要求11至14任一项的方法，其中所述胚胎干细胞是人、非人 灵长类动物、马、犬、牛、猪、山羊、绵羊、鱼、啮齿动物、鼠或鸟类来 源的。

16.前述任一项权利要求的方法，其中提供包裹在每个支持基质结构中 的多个细胞。

17.前述任一项权利要求的方法，其中提供包裹在每个支持基质结构中 的单个细胞。

18.前述任一项权利要求的方法，其中在步骤(a)中提供多个支持基 质结构。

19.前述任一项权利要求的方法，其中支持基质结构为小珠的形式。

20.包裹在支持基质中的人胚胎干细胞用于评估试验刺激对细胞维持 和/或分化的影响的用途。

21.包裹在支持基质中的人胚胎干细胞用于评估培养基和/或培养条件 对细胞维持和/或分化的影响的用途。

22.权利要求1的方法，其还包括在存在试验化合物的情况下在维持培 养基中温育被包裹的细胞，和评估试验化合物对细胞维持和/或分化的影响。