[发明专利]新的微生物酶及其应用

说明书

发明领域

本发明涉及酶技术，并且更确切地说，涉及新的真菌酶蛋白及其应用。本发明进一步涉及编码所述酶的多核苷酸，生产它们的方法和用于生产所述酶的表达载体和宿主细胞。

发明背景

酶用于各种类型的纸浆和造纸工业、纺织工业以及食品、饲料和饮料工业的生产过程。酶还用于化妆品和制药工业以及洗涤剂。工业化酶可以来源于动物、植物或微生物并且优选胞外酶。它们通常更为稳定并且易于通过重组技术生产。从宿主细胞中分离和纯化胞内酶成本高并且费力且因此如果所述的酶为胞外酶，即从细胞中分泌的蛋白质，那么是有利的。此外，需要的是可以以工业化规模大量生产所述的酶并且生物体是安全的且对培养而言是便利和经济的。

蛋白质为可再生原料中的重要成分且因此食品、纺织纤维等包含大量蛋白质。酶可以用于修饰蛋白质和改变它们在这些材料中的技术性能。蛋白质基质可以由能够降低蛋白质分子量的水解酶(蛋白酶)来修饰。蛋白质还可以由能够在蛋白质的氨基酸残基之间产生共价交联键的酶(作为实例的转谷氨酰胺酶，它在赖氨酸与谷氨酰胺残基之间产生同工肽键)或由能够氧化某些氨基酸残基的酶来修饰。氧化某些氨基酸残基反过来也可以导致交联键的形成。通过交联修饰蛋白质材料通常用于例如食品加工。就食品质量而言，质地是极为重要的因素。它不仅涉及感官知觉，而且涉及保水能力、胶凝和乳化性能以及稳定性。

通过蛋白质交联的酶辅助的结构改造可以应用于几种食品应用，例如肉类、鱼类、乳制品和谷类加工。转谷氨酰胺酶为众所周知的酶，例如，它用于使肉类部分低温结合在一起以便产生重构的肉类产品，使切碎的肉类产品的质地和保水能力改善，鱼生料结构的改善，具有良好保水性而无不良的脱水收缩作用的酸乳酪生产中的乳凝胶形成，防止烹调后面食制品的质地劣化，改善由低级面粉焙烤的面包的面包体积。例如，使用转谷氨酰胺酶对素食品进行酶促交联披露在WO03/007728中。

已知转谷氨酰胺酶通过在不同蛋白质中/之间形成ε(γ-谷氨酰)赖氨酸同工肽键催化蛋白质中或之间的交联，所述的蛋白质诸如为肌球蛋白、明胶和胶原蛋白、酪蛋白、酪蛋白酸盐、乳清蛋白、大豆蛋白、谷蛋白、卵蛋白(Kuraishi等，2001；Nielsen，1995)。然而，反应性依赖于蛋白质底物中的靶氨基酸，即赖氨酸和谷氨酰胺的可利用性和易接近性。因此，并非所有蛋白质均为转谷氨酰胺酶的合适的底物，这是因为蛋白质中的谷氨酰胺或赖氨酸残基的易接近性不足或质量有限。

使用氧作为电子受体的酚氧化酶特别适合于酶促方法，因为在反应中不需要单独的需昂贵再生的辅因子，即NAD(P)H/NAD(P)。这些酚氧化酶包括：例如，漆酶和酪氨酸酶。它们均为铜蛋白并且可以氧化各种酚类化合物。漆酶和酪氨酸酶的底物特异性部分重叠。

酪氨酸酶催化一酚类和芳族胺类的邻位-羟基化并且将邻-二酚类氧化成邻-醌类或将邻-氨基苯酚类氧化成邻-醌亚胺类(Lerch，1981)。传统上，可以基于对抑制剂的底物特异性和敏感性区分酪氨酸酶与漆酶。然而，这种区别目前基于结构特征。在结构上，酪氨酸酶与漆酶的主要差别在于酪氨酸酶具有双核铜位点，在其活性位点上带有两个III型铜，而漆酶在活性位点上总共带有四个铜原子(I型和II型铜和一对III型铜)。

酪氨酸酶能够将蛋白质中的酪氨酸残基氧化成相应的醌类，这些醌类可以进一步与例如游离巯基和/或氨基反应生成酪氨酸-半胱氨酸和酪氨酸-赖氨酸交联(Ito等，1984)。还提示了醌类通过彼此偶联形成酪氨酸-酪氨酸键合。

例如，通过漆酶交联蛋白质的方法已经披露在US2002/9770中。将来源于豆类和谷类的植物蛋白和动物蛋白，包括乳、蛋、肉类、血液和腱列为合适的底物。然而，漆酶与蛋白质并且还与其它可能的底物(例如酚类成分)形成游离基。因此，该过程比醌衍生的由酪氨酸酶催化的非游离基反应更难以控制。在漆酶催化的反应中，某些稳定的游离基也可以保留在基质内，导致解聚和随后的作为时间函数的基质破坏。真菌漆酶披露在US2002/19038中。

已经综述了酪氨酸酶交联食物蛋白的能力(Matheis和Whitaker，1984；Matheis和Whitaker，1987)。在这些研究中，使用了胞内蘑菇属(Agaricus)酪氨酸酶。蛋白质与酪氨酸酶的交联通过由蛋白质结合的酪氨酸形成邻-醌类进行。这些邻-醌类彼此缩合或与存在于蛋白质中的游离氨基和巯基反应。