[发明专利]使用双特异性寡核苷酸的方法及所述双特异性寡核苷酸

说明书

技术领域

本发明涉及多种使用双特异性寡核苷酸的多种方法及所述双特异性寡核苷酸。更具体而言，本发明涉及多种使用双特异性寡核苷酸的通过模板依赖性延伸反应的方法及所述双特异性寡核苷酸。

背景技术

核酸扩增是分子生物学中多种方法的关键方法，从而已提出了多种扩增方法。例如，Miller，H.I.等人(WO 89/06700)基于启动子/引物序列与目标单链DNA(″ssDNA″)杂交，然后转录该序列的多个RNA拷贝而扩增核酸序列。其它已知的核酸扩增方法包括基于转录的扩增体系(Kwoh，D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，86：1173(1989)；和GingerasT.R.等人，WO 88/10315)。

用于核酸扩增的最主要的方法已知为聚合酶链式反应(下文称为″PCR″)，其基于如下重复循环：双链DNA的变性，然后寡核苷酸引物与DNA模板退火，且通过DNA聚合酶引物延伸(Mullis等人，美国专利号4,683,195，4,683,202和4,800,159；Saiki等人，(1985)Science 230，1350-1354)。设计PCR中使用的寡核苷酸引物使其与DNA模板的互补链退火。引物通过DNA聚合酶延伸，一条引物由此产生的产物在后续反应中可以用作另一条引物的模板链。PCR扩增法导致其长度由寡核苷酸引物的5′端限制的不连续DNA片段的指数式增加。

核酸扩增，尤其是PCR扩增的成功取决于引物只与其目标(而不与非目标)序列退火的特异性，因此，使这种分子相互作用最优化很重要。引物是否可以只与其完全互补序列退火或还与具有一个或多个错配的序列退火关键取决于退火温度。通常，退火温度越高越会导致引物与其优选的配对模板之间的更特异性退火，从而依次增加只扩增目标序列的可能性。另一方面，较低的退火温度会容许模板与引物之间更多的错配。鉴于这种现象，调整退火温度可以改变模板与引物配对的特异性。例如，如果没有产物，该温度对于退火会太高。如果产生几种大小不同的产物且其中只有一条引物存在，其说明单一引物与模板的多个区域退火。在这种情况下应该提高退火温度。

对于引物退火特异性，除了退火温度，还应考虑几个“引物研究参数”，如引物长度、GC含量和PCR产物长度。满足上述全部参数的引物会导致目标DNA扩增过程中引物退火特异性的显著提高，从而解决由试验中使用的引物产生的背景和非特异性产物的问题。通常，设计较好的引物可以有助于避免非特异性退火和背景，以及在RNA-PCR中区分cDNA或基因组模板。

已开发了多种方法以提高引物退火特异性，并因此完成所需产物的扩增。例子为：递减PCR(Don等人，(1991)Touchdown PCR tocircumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res.，19，4008)、热启动PCR(DAquila等人，(1991)Maximizing sensitivity andspecificity of PCR by pre-amplifcation heating.Nucleic Acids Res.，19，3749)、巢式PCR(Mullis和Faloona，(1987)Specific synthesis of DNA invitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.Methods Enzymol.155，335-350)和加强PCR(Ruano等人，(1989)Biphasic amplification of verydilute DNA samples via booster PCR.Nucleic Acids Res.17，540)。其它选择性方法还已经报道多种‘增强子’化合物可以提高PCR的特异性。所述增强子化合物包括提高反应的有效退火温度的化学物、DNA结合蛋白和市售试剂。然而，不存在会确保每个PCR成功的‘魔力’添加剂，在如退火温度的不同条件下试验不同的添加剂十分烦琐。虽然这些方法已有助于在一些情况中改进引物退火特异性，但是其不能从根本上解决由PCR扩增中使用的引物引起的问题，如非特异性产物和高背景。