[发明专利]在包含植物蛋白水解产物的无血清细胞培养液中生产多肽

说明书

发明领域

本发明涉及用于在无血清培养液中于真核细胞中生产目的多肽的改进方法。

发明背景

用于在真核细胞中大规模生产多肽例如凝血因子VII多肽的方法是本领域已知的，参见例如WO02/29083、WO02/29084和WO03/29442。

在多肽例如凝血因子VII多肽的大规模生产中，出于经济原因希望延长生产阶段以便从为了细胞培养物的繁殖而付出的努力中充分获益。此外，设想在较长的时间段内更均匀的多肽生产速率将致使多肽批次更均一，因为认为对于“非应激的”细胞培养，翻译后过程(例如糖基化和γ-羧酸的形成)可更精确地进行。

WO01/23527公开了用于无蛋白质和无血清细胞培养的细胞培养基。该培养基包含一定比例的大豆水解产物(大豆蛋白胨)。

发明简述

本发明涉及在培养过程中改变细胞培养液中的植物蛋白水解产物组分的浓度，以便，同时，1)在繁殖阶段期间实现最佳细胞生长，和2)在生产阶段中实现最佳的、长期的、关于性能的培养稳定性，并且从而增加所考虑的多肽例如凝血因子VII多肽的总产率。

本发明的第一个方面涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产多肽的方法，所述方法包括

(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和

(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，

其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，并且其中第一种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C₁)和第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C₂)之比为至少1.5:1(C₁:C₂)。

本发明的第二个方面涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括

(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和

(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，

其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，例如大豆蛋白水解产物，并且其中所述第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C₂)为0.7-3.0g/L。

附图简述

图1举例说明了培养过程的流程图。

图2的图表显示了来自在20L发酵罐中的微载体培养的结果，参照实施例1。

图3的图表显示了来自在500L发酵罐中的微载体培养的结果，参照实施例2。

发明详述

如上所述，本发明的一个主要方面涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产多肽的方法，所述方法包括

(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和

(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，

其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，并且其中第一种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C₁)和第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C₂)之比为至少1.5:1(C₁:C₂)。

术语“大规模生产”指涉及至少100L的培养容器的生产。然而，在优选实施方案中，规模一般为至少250L，例如至少500L，例如至少1000L或甚至5000L或更大。术语“大规模”可以与术语“工业规模”和“生产规模”互换使用。

用于大规模生产多肽的方法一般在至少120小时例如1-26周的时间段内进行。

本发明应被理解为迄今已知的用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产多肽的方法的改进。已知在此类方法中使用植物蛋白水解产物，但本发明提供了用于改进此类方法的结果的指导。

本发明主要方面的方法的特征是，以使得繁殖阶段以及生产阶段最优化的方式控制细胞培养液中植物蛋白水解产物的含量。这是通过确保第一种细胞培养液(用于繁殖阶段)中植物蛋白水解产物的浓度(C₁)和第二种细胞培养液(用于生产阶段)中植物蛋白水解产物的浓度(C₂)之比为至少1.5:1(C₁:C₂)来完成的。