[发明专利]质粒DNA的纯化方法

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求提交于2005年1月31号的美国临时专利申请60/648,670的优先权，此处纳入本文作为参考。 

发明领域

本发明涉及分离临床级质粒DNA方法，从生产工艺包括大规模发酵方法，包括两种可选的纯化质粒DNA的核心单元操作。在这里公开的新型上游和下游纯化工艺用于降低产品成本和提高工艺稳定性。本发明中描述的新型上游纯化工艺部分包括了裂解/溶胞产物澄清两个步骤：首先产生含质粒DNA的宿主细胞溶胞产物，然后絮凝宿主细胞碎片进行澄清。作为本发明另一部分描述的，一种新型的下游纯化工艺包括从富含所述DNA的宿主细胞溶胞产物沉淀质粒DNA，并在切向流过滤模式下微量过滤所述沉淀的DNA。此处公开的两种或两种之一的纯化工艺可以与在质粒DNA纯化技术领域所知的其它纯化步骤结合使用。 

发明背景 

多聚核苷酸疫苗是一种诱导保护性免疫来抵抗殊定疾病的新型方法，该方法既能产生中和性抗体又能激活更好的细胞介导的免疫反应(Montgomery，D.L.等.，1993，Cell Biol.169：244-247；Ulmer，J.B.等.，1993，Science 259：1745-1749)。将含有编码目的抗原基因以及哺乳动物细胞的有效启动子的质粒DNA送入体内并被转进肌肉细胞。抗原DNA被转录和翻译，其发表出的蛋白被转送至细胞表面用于T细胞呈递。在临床前的疾病模型实验中，许多传染性疾病的DNA疫苗的都表现出了免疫原性和疗效(综述见Gurunathan，S.等.，2000，Ann.Rev.Immunol.18：927-974)。质粒DNA也用于基因治疗，包括将功能基因带入体内，将所述基因导入目标细胞并表达治疗产物，以选择性地调节病情。这样，基因疗法代表着一种预防、治疗或治愈遗传疾病的可选方法。许多基于质粒DNA基因疗法的临床试验已经开始(综述见Mountain，A.，2000，TIBTECH 18：119-128；和Ferber，D.，2001，Science294：1638-1642)。 

生产和纯化大量的药用级别质粒DNA是多聚核苷酸疫苗和基因疗 法得以可行的关键。作为部分预防和治疗方案，使用多聚核苷酸疫苗或基因疗法来对抗疾病的潜在人群数量是十分庞大的，这将对临床级质粒产生很高的需求量。这样，高产量质粒DNA的生产方法和纯化工艺对全面发展和挖掘多聚核苷酸疫苗和基因疗法的优势是必需的(Shamlou，P.A.，2003，Biotechnol.Appl.Biochem.11：207-218)。虽然前期在小规模质粒DNA纯化的方法学上有很多研究成果，但是将其放大到生产和纯化临床级质粒DNA上则证明是有较多问题的(Prazeres，D.M.F.等人，1999，TlBTECH 17：169-174)。而且，革新大规模生产工艺必须平衡优质和成本问题以跟上市场要求和需求(Shamlou，2003，supra)。本发明公开一种质粒DNA纯化的高度生产性、可调控和重复性工艺，能降低成本，提高生产工艺的稳定性。本工艺展示了一种新的溶解细胞和溶胞产物澄清的程序，包括宿主细胞碎片的聚合物絮凝作用。这种新的溶解和絮凝作用过程可以与一种新型的下游提纯步骤，包括质粒DNA沉淀(用聚乙二醇或醇)和后续的切向流过滤模式下的微量过滤，进行结合使用。