[发明专利]质粒DNA的纯化方法

权利要求书

1.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA 的方法，所述方法包括：

(a)裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞 溶胞产物；

(b)通过用聚乙二醇(PEG)絮凝宿主细胞碎片来澄清所述宿主 细胞溶胞产物，其中所述PEG的浓度是使絮凝步骤期间质粒DNA沉 淀的可能性最小的浓度；和

(c)除去絮凝的宿主细胞碎片，产生含有所述超螺旋质粒DNA 的澄清的溶胞产物。

2.权利要求1的方法，其中将步骤(a)的宿主细胞在含溶菌酶的 标准STET缓冲液中裂解。

3.权利要求2的方法，其中STET缓冲液含PEG。

4.权利要求1的方法，其中在溶胞作用后向宿主细胞溶胞产物中 加入PEG。

5.权利要求4的方法，其中PEG絮凝剂的分子量在1450Da到 15,000Da之间。

6.权利要求4的方法，其中在加入PEG前将宿主细胞溶胞产物的 pH调至碱性，随后再中和。

7.权利要求6的方法，其中将pH调至碱性和随后的中和反应包 括将宿主细胞溶胞产物的pH升高到pH 12-pH 13的碱性值，随后降 低所述细胞溶胞产物的pH到pH 7-pH 9的值。

8.权利要求4的方法，其中在加入PEG后将宿主细胞溶胞产物的 pH调至碱性，随后再中和。

9.权利要求8的方法，其中将pH调至碱性和随后的中和反应包 括将含PEG的宿主细胞溶胞产物的pH升高到pH 12-pH 13的碱性 值，随后降低所述溶胞产物的pH到pH 7-pH 9的值。

10.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA 的方法，所述方法包括：

(a)在生理裂解缓冲液中裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主 细胞，形成宿主细胞溶胞产物；

(b)通过将所述溶胞产物的pH升高到pH 12-pH 13，使步骤(a) 中的宿主细胞溶胞产物的pH调至碱性；

(c)中和步骤(b)中调至碱性的细胞溶胞产物至pH 7-pH 9；

(d)通过用PEG絮凝宿主细胞碎片，来澄清步骤(c)的细胞溶 胞产物，其中所述PEG的浓度是使絮凝步骤期间质粒DNA沉淀的可 能性最小的浓度；和，

(e)除去步骤(d)的所述絮凝的宿主细胞碎片，获得含可溶超 螺旋质粒DNA的上清液。

11.权利要求10的方法，其中步骤(a)的生理裂解缓冲液是标准 STET缓冲液。

12.权利要求10的方法，其中在步骤(d)和(e)之间加入去垢 剂诱导的沉淀步骤来沉淀碎片和非超螺旋质粒，进一步澄清细胞溶胞 产物。

13.权利要求12的方法，其中去垢剂是溴化十六烷基三甲基铵 (CTAB)。

14.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA 的方法，所述方法包括：

(a)在生理裂解缓冲液中裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主 细胞，形成宿主细胞溶胞产物；

(b)通过用PEG絮凝剂絮凝宿主细胞碎片，来澄清所述宿主细 胞溶胞产物，其中所述PEG絮凝剂的浓度是使絮凝步骤期间质粒DNA 沉淀的可能性最小的浓度；

(c)用PEG沉淀所述超螺旋质粒DNA；和

(b)通过切向流过滤模式下的微量过滤来浓缩所述沉淀的超螺旋 质粒DNA。

15.权利要求14的方法，其中将步骤(a)的所述宿主细胞在标准 STET缓冲液中裂解。

16.权利要求15的方法，其中在加入PEG絮凝剂前将宿主细胞溶 胞产物的pH调至碱性，随后再中和。