[发明专利]一种纤溶酶及其培制方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纤溶酶，本发明还涉及一种该纤溶酶的培制方法。

背景技术

血栓类疾病严重的威胁着人类的生命和健康，是导致当今人类死亡的最主要原因之一，而且在目前这种病的发病率仍然在逐年上升。眼下血栓疾病的治疗方法主要有三种：一是外科手术法，从操作上看，这种方法对技术的条件要求很高，操作上难度也很大，患者需要付出的费用也很昂贵。二是抗栓疗法，即给患者长期服用阿斯匹林等抗凝药物，虽然在很大程度上可以控制病情，但是却不能除去已经形成的血栓。三是溶栓疗法，即给患者注射溶栓剂以促使血管再通，这种方法与前两种方法比具有高效、特异、费用低等特点，因此溶栓药物的研究开发在国际、国内都相当活跃。从六十年代溶栓药物上市到现在，溶栓剂的发展大致分三代：第一代溶栓剂：包括链激酶(streptokinase，SK)、尿激酶(urokinase，UK)等，所存在的不足是这类制剂具有其自身难以克服的缺陷，如引起出血等副作用等。第二代溶栓剂：包括t-PA、pro-UK、APSAC，这些制剂虽然较上一代产品已有所改进，但是这种缺陷依然存在。第三代溶栓剂是正在研究开发中的溶栓药物。目前国际上正在致力于以下两种研究：一是用蛋白质工程，如分子定点突变，结构域的删除、增加、拼接或融合等手段对现有溶栓剂分子进行改造。二是积极开发各种生物来源的血栓溶解物质。现已有从蛇毒、蚯蚓、微生物以及吸血昆虫和海洋生物中提取到了具有纤溶活性的物质的报道。在自然界，由于微生物的种类繁多，来源广泛，再加上其自身所具有的繁殖快，生长周期短，适应性强的优势，各国的发酵工业又都有较为完备甚至是十分发达的基础，一旦有了成熟的工艺，很快就可以大批量地生产，因此，应用微生物生产溶栓剂展示出了特别诱人的前景。

目前，国内有关纤溶酶的研究可以说是才刚刚开始，已有的少量成果主要还局限于蚯蚓纤溶酶，此外，仅有几项从链霉菌Y405、链霉菌C3662发酵液中提取到的纤溶酶等报导。在临床应用研究中，需要具有大量的备选品种和相关产物以便于加以比较和从中筛选，而目前我们现已取得的进展还远远不能满足临床上的研究需要。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种纤溶酶，该纤溶酶不仅具有很好的溶栓性能，而且使用上安全性好，制备成本也很低廉。本发明的另一个发明目的还在于提供一种该纤溶酶的培制方法。

本发明产品纤溶酶培养所使用的菌种为Neurospora sitophlia 17号好食脉孢霉，保藏号为CGMCC No.1836。该菌株是本申请人于1999年3月在中国北方酱类食品发酵中间产物酱块中分离、筛选得到的。

以上述菌株为菌种，经过培养发酵、分离和提纯，便可培制出本发明的纤溶酶产品。

本发明的培制的纤溶酶经SDS-PAGE法和凝胶过滤层析法的分析测定，被证实为具有以下酶学性质：该纤溶酶酶分子由两个亚基组成，相对分子量分别为30000和15500，IEF测定等电点为7.9±0.2。

该纤溶酶酶分子有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的作用，可以顺次降解纤维蛋白原α、β和γ链。还可以水解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，测得的酶促反应的米氏常数为0.24mmol/L；该纤溶酶不降解人血清蛋白，最适作用pH为7.4，适宜在人体生理pH下发挥作用，在pH4.8-9.8范围内37℃保温24h后酶活力保持在80％以上；最适作用温度为50℃，在32℃-42℃保温4h酶活力保持在75％以上；Fe²⁺和Fe³⁺在离子浓度为0.5mmol/L时对酶的活性有激活作用，该纤溶活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制。

本发明产品的培制方法：以Neurospora sitophlia 17号好食脉孢霉为菌种，经固体发酵法培养后产生纤溶酶，将固体发酵物用生理盐水浸提6h，用纱布过滤除去菌体和固形物，收集滤过液，用40％～80％饱和度的硫酸铵分级盐析，再采用现代色谱分离技术对该纤溶酶进行纯化，使酶纯度达到色谱纯。

本发明产品的制备具体步骤：

1、以Neurospora sitophlia 17号好食脉孢霉为菌种，经过斜面培养、固体发酵培养生产纤溶酶；

2、培养方法：斜面培养—→固体发酵培养