[发明专利]烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于检测材料，尤其涉及一种烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法。

背景技术

烟草马铃薯Y病毒病又称烟草脉带病，在世界各烟区均有分布。近年来，我国的黄淮、西南、东北等烟区都有加重发生的趋势，在部分烟区已经造成了较大的经济损失。马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)的核酸是长约10kb的正链ssRNA，主要在农田杂草和茄科植物上越冬，温暖地区则连续不断地在寄主上繁殖侵染；通过蚜虫、汁液摩擦、嫁接等多种途径传毒，在自然条件下仍以蚜虫传播为主；侵染烟草后初期新叶上都表现明脉，后期由于其株系较多，引起的症状各不相同使得田间症状十分复杂。

目前烟草花叶病毒病的检测方法有电镜法和血清学法两种。电镜法是检测病毒最可靠最有效，主要有负染法和组织超薄切片法，可以直接观察到病毒的形态特征、内部结构及病毒混合感染的情况。血清学法需要制备完整病毒的抗血清，用各种血清反应方法进行检测。

但这两种方法都需要将样品中病毒或核酸提取和纯化，需要超高速离心机以及电子显微镜等设备，虽然血清学法特异性比较强，但在病毒浓度较低时，制备的抗血清效价不高，检测效果不理想。因此需要有一个快速简便、可靠性高的检测方法来进行检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法，有这种试纸条可快速简便地进行检测，且可靠性高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法，包括制备抗体、制备胶体金、制备胶体金-抗体结合物、制备硝酸纤维素膜和制备胶体金层析检测试纸的步骤，在制备抗体的步骤中，要制备兔多克隆抗体：用无菌生理盐水将烟草马铃薯Y病毒抗原稀释为2mg/ml，然后加Freud’s佐剂，第一次为完全佐剂，以后用不完全佐剂；抗原注射量为0.1～0.2mg/kg，选用2～3Kg的兔子，采取静脉注射方式，分三次完成，每次注射抗原用量0.03～0.1mg，间隔时间为10d，末次注射10d后进行放血，放血前动物禁食12h，采用耳静脉放血40～60ml，收集后离心除去血细胞，纯化后零下20℃保存；并用同样的方法制备羊抗兔抗体。

在制备胶体金的步骤中，取1％氯金酸0.6ml在30ml超纯水中加热煮沸，快速一次加入37℃预温的1％柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3～5min，补水至30ml；冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾调pH至7.2～7.5，然后用0.22μm滤膜进行过滤，制备20～30nm胶体金颗粒。

在制备胶体金-抗体结合物的步骤中，取1mg纯化的烟草马铃薯Y病毒抗体，边搅拌边注入到50ml胶体金溶液中，室温下搅拌1h，然后加10％牛血清蛋白2ml，室温下搅拌5min，再加10％聚乙二醇1ml，室温下搅拌5min，12000～15000rpm离心50min，沉淀溶于5ml保存液中，用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。

在制备硝酸纤维素膜的过程中，将3ml胶体金-抗体结合物和3ml TBS缓冲液混匀，放入硝酸纤维素膜(NC膜)浸泡10mln，取出在37℃烘箱中烤干，热合封口，4℃保存备用；然后将烟草马铃薯Y病毒的兔多克隆抗体和羊抗兔抗体分别用固相溶液稀释成3mg/ml和1mg/ml，两种抗体分别取1μl，依次点样在NC膜上，即检测线和质控线，固相抗体NC膜在0.5％BSA封闭液中，37℃下孵育1h后，洗涤液中洗2次，室温下风干，4～8℃保存。

在制备胶体金层析检测试纸的步骤中，取一块洁净的PVC板，将包被的NC膜固定在适当的位置上，将引水材料连接在NC膜的下端，吸水材料连接在NC膜的上端，胶体金-抗体结合物硝酸纤维素膜置于引水材料下与NC膜衔接，用切割机将组装后的PVC板纵向切成6mm宽的测试条，将其装入板壳即可。

采用上述技术方案制备的烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条，检测适温15～35℃，检样量0.1～0.3g的样品，相当于叶面积大约3～5cm²；将烟叶在装有缓冲液的塑料袋中研磨后，将试纸条浸入，30min出结果；假阳性率低于1％。可见本发明使用方便，特别适用于田间快速检测，并且可靠性很高。

具体实施方式

实施例1：