[发明专利]烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法

权利要求书

1.一种烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法，包括制备抗体、制备胶体金、制备胶体金-抗体结合物、制备硝酸纤维素膜和制备胶体金层析检测试纸的步骤，其特征在于：在制备抗体的步骤中，要制备兔多克隆抗体：用无菌生理盐水将烟草马铃薯Y病毒抗原稀释为2mg/ml，然后加Freund’s佐剂，第一次为完全佐剂，以后用不完全佐剂；抗原注射量为0.1～0.2mg/kg，选用2～3Kg的兔子，采取静脉注射方式，分三次完成，每次注射抗原用量0.03～0.1mg，间隔时间为10d，末次注射10d后进行放血，放血前动物禁食12h，采用耳静脉放血40～60ml，收集后离心除去血细胞，纯化后零下20℃保存；并用同样的方法制备羊抗兔抗体。

2.如权利要求1所述的烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：在制备胶体金的步骤中，取1％氯金酸0.6ml在30ml超纯水中加热煮沸，快速一次加入37℃预温的1％柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3～5min，补水至30ml；冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾调pH至7.2～7.5，然后用0.22μm滤膜进行过滤，制备20～30nm胶体金颗粒。

3.如权利要求1或2所述的烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法，其特征在于；在制备胶体金-抗体结合物的步骤中，取1mg纯化的烟草马铃薯Y病毒抗体，边搅拌边注入到50ml胶体金溶液中，室温下搅拌1h，然后加10％牛血清蛋白2ml，室温下搅拌5min，再加10％聚乙二醇1ml，室温下搅拌5min，12000～15000rpm离心50min，沉淀溶于5ml保存液中，用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。

4.如权利要求3所述的烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：在制备硝酸纤维素膜的过程中，将3ml胶体金-抗体结合物和3mlTBS缓冲液混匀，放入硝酸纤维素膜(NC膜)浸泡10mln，取出在37℃烘箱中烤干，热合封口，4℃保存备用；然后将烟草马铃薯Y病毒的兔多克隆抗体和羊抗兔抗体分别用固相溶液稀释成3mg/ml和1mg/ml，两种抗体分别取1μl，依次点样在NC膜上，即检测线和质控线，固相抗体NC膜在0.5％BSA封闭液中，37℃下孵育1h后，洗涤液中洗2次，室温下风干，4～8℃保存。

5.如权利要求1所述的烟草马铃薯Y病毒田间快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：在制备胶体金层析检测试纸的步骤中，取一块洁净的PVC板，将包被的NC膜固定在适当的位置上，将引水材料连接在NC膜的下端，吸水材料连接在NC膜的上端，胶体金-抗体结合物硝酸纤维素膜置于引水材料下与NC膜衔接，用切割机将组装后的PVC板纵向切成6mm宽的测试条，将其装入板壳即可。