[发明专利]利用改良的肠杆菌科菌株制备L－氨基酸的方法

说明书

本发明涉及利用肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的重组微生物菌株制备L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)的方法，其中，增强(尤其是过表达)名称为ytfQ的开放阅读框(ORF)，还涉及所述的微生物。

现有技术

L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)用于人用药和制药工业中，用于食品工业中，更特别地，用于动物营养品中。

已知L-氨基酸可通过发酵肠杆菌科菌株，尤其是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)来制备。因为其巨大的重要意义，人们不断努力以改良制备方法。方法上的改良可以考虑所涉及的措施，这些措施涉及，发酵技术，如搅拌或供氧，或营养培养基的组成，如发酵期间的糖浓度，或产品形式的加工，如通过离子交换色谱的方式进行，或微生物本身的内在性能特点。

诱变、选择和突变体选择的方法用于改良这些微生物的性能特点。由此产生了对代谢拮抗物(如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV))有抗性的株、或具有调节重要性的代谢物的营养缺陷型，并产生诸如L-苏氨酸的L-氨基酸。

许多年来，通过扩增单个氨基酸生物合成基因并研究对产量的影响，重组DNA方法也已经用于改良产L-氨基酸的肠杆菌科菌株了。有关大肠杆菌和沙门氏菌细胞生物学和分子生物学的汇总的信息可在Neidhardt(编)：Escherichiacoli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，第二版，ASM Press，华盛顿特区，美国(1996)中找到。

发明目的

本发明的目的在于提供用于改良L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)发酵制备的新措施。

发明内容

本发明涉及肠杆菌科的重组微生物，其包含增强或过量表达的开放阅读框ytfQ或编码该基因产物的核苷酸序列，ytfQ编码被注释(annotated)为ATP依赖性糖转运蛋白的推定的结合蛋白的多肽，所述微生物显示出形成并积累L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)的改进的能力。

在每种情况下，将微生物用作为比较的起点，所述微生物对ytfQ-ORF来说不是重组的，其不合任何增强的ytfQ-ORF，并对其用本发明的措施进行处理。

特别地，这些重细微生物包括肠杆菌科微生物，其中编码多肽的多核苷酸被增强，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的氨基酸序列有至少80％或至少90％、尤其至少95％、优选至少98％、至少99％、尤其优选99.6％并更尤其优选100％同一性。

所述微生物包含增强或过量表达的选自以下组的多核苷酸：

a)具有选自SEQ ID No.1和SEQ ID No.3及其互补核苷酸序列的多核苷酸；

b)具有在遗传密码简并范围内相应于SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的核苷酸序列的多核苷酸；

c)多核苷酸序列，其具有的序列在严紧条件下与序列SEQ ID No.1或SEQ IDNo.3的互补序列杂交，严紧条件优选通过洗涤步骤来实现，所述洗涤步骤中温度范围为64℃至68℃，缓冲液盐浓度范围为2xSSC至0.1xSSC；

d)具有序列SBQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸，其包含功能中性的有义突变体，所述多核苷酸优选编码ATP依赖性糖转运蛋白的推定的结合蛋白。

本发明也涉及利用肠杆菌科的重组微生物发酵制备L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)的方法，所述微生物尤其是已经能生产L-氨基酸的，并在其中至少增强了具有名称为ytfQ的开放阅读框(ORF)或编码其基因产物的核苷酸序列。

利用所述微生物进行优选方案。

如下文所述的L-氨基酸或氨基酸，指的是一种或更多种氨基酸，包括它们的盐，所述氨基酸选自L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸。尤其优选L-苏氨酸。

在上下文中，术语“增强”表示在微生物中，一种或更多种酶或蛋白质的细胞内活性或浓度的增加，所述酶或蛋白质由相应DNA编码，例如其中，基因的拷贝数或ORF的拷贝数增加了至少一个(1)拷贝，利用与基因可操作相连的强启动子、或编码相应具有高活性的酶或蛋白质的基因或等位基因或ORF，而且在合适时，这些措施可组合使用。