[发明专利]一种针对人OPN基因用于肿瘤基因治疗的短的干扰核糖核酸

说明书

本发明公开了一种针对人OPN基因用于肿瘤基因治疗的短的干扰核糖核酸(short interfering RNA，siRNA)。该siRNA使用RNA干扰技术，通过利用短片断的双链RNA促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因沉默的表型，被研究人员应用到疾病治疗领域。OPN基因表达一种多功能蛋白质，参与人肿瘤发生和转移。它广泛存在于正常成人组织和体液中。我们通过实验证明，抑制OPN基因表达之后，肿瘤细胞生长受到明显抑制。

技术领域

本发明涉及一种具有特异性肿瘤治疗的RNA干扰片段制备方法。

背景技术

RNAi的高度特异性和相对宽松的设计条件，使RNAi不仅可以应用于基因功能研究，更广泛的，RNAi将被应用到基于基因组序列的核酸药物研究和药物靶标验证中。

截止2000年末，共计215个基于基因水平治疗的药物在研，其中87个为基因治疗药物，62个为DNA疫苗，35个为针对RNA的反义核酸和核酶。具体数据见下表：

截止2000年底，基于基因组的在研药物分布表

由上表可见，RNA攻击核酸制药迄今为止是以反义核酸为主，核酶技术为辅的一个领域。1997年ISIS制药公司的抗病毒反义核酸药物得到美国医药食品管理局的批准，为反义核酸药物的发展提供了先例。近年高等动物功能基因组研究正在以更快的速度为反义核酸药物的发展提供靶基因，使反义核酸药物的适用范围从癌症向传染病，心血管疾病，炎症及自身免疫等多方面扩张。2001年8月ISIS将蛋白激酶C的反义核酸药物以2亿美元的高价转让给大制药公司EliLilly，2002年4月，世界第二大反义核酸药物公司Genta将其bcl-2的反义核酸药物以4.8亿美元的高价转让给大制药公司Aventis标志了反义核酸药物的发展走向成熟并进入制药业的主流。这不仅是反义核酸的成功，而更重要的是以RNA攻击为手段的制药思路和领域的成功。与反义核酸药物相比，siRNA在体外显示了非常优越的性质。siRNA和非常好的反义核酸对基因的表达抑制都可以达到在80-90％以上，但筛选这样的siRNA要相对容易的多。而且，达到同样水平的表达抑制所需的siRNA比反义核酸浓度低10-100倍。不仅如此，siRNA对基因表达抑制的有效时间也比反义核酸有较大的延长(从两天延长到5-7天)。siRNA在体外显示的这些优越性质，如果能在RNA攻击制药中体现出来，将为着一领域注入强大的生命力和价值。从哲学的角度，siRNA这一有效的基因操作手段和RNA攻击这一成熟的制药领域的结合是不可避免的。

siRNA一旦进入制药，首先将在病毒性传染病如HIV和癌症如白血病的治疗方面形成巨大的经济效益。中国在这两个方面有以百亿计的市场，世界在癌症和病毒性传染病的治疗方面还存在大的空白，siRNA的介入可以产生很好的社会作用。如果中国在这一领域实现突前发展，对提高中国制药业在加入WTO后的竞争力有重要意义。

吉凯基因早在2002年就开始RNA干扰开发和相关技术研究，针对OPN基因制备的可以抑制肿瘤细胞生长的siRNA是长期研究的结果之一。

发明内容

本发明的目的在于利用RNA干扰技术，制备一种可以用于肿瘤基因治疗的核心分子，这种核心基因治疗分子是以RNA干扰技术作为基础的。

本发明的上述目的是通过下述技术方案实现的：

A.从genebank中调取human OPN基因序列；

B.利用GeneChem软件预测有效的siRNA位点；

C.合成12个针对OPN基因的siRNA；

D.12个siRNA转染293T细胞；

E.RT-PCR检测这些siRNA对OPN基因的mRNA的抑制作用；

F.Western检测这些siRNA对OPN基因的蛋白表达水平的抑制作用；

G.筛选mRNA水平和蛋白质水平抑制作用超过90％的siRNA。

H.该siRNA是本权利要求书要求的专利材料。

I.对该siRNA进行LNA化学修饰，增加其稳定性。

J.将该siRNA构建入病毒载体，进行细胞学和动物水平实验研究。

所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对human OPN基因)，其特征在于：其序列为：

5’GCAGCTTTACAACAAATACCC3’

5’TCTCCTTGCGCCACAGAAT3’

5’GGACAGTTATGAAACGAGT3’