[发明专利]一种微生物固定化包埋颗粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃(PAHs)污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其是以海藻酸钠(Na·Alg)为主要载体材料，以泥炭土、红砖粉、粉煤灰等为辅助载体的包埋固定化微生物工艺，可使固定化颗粒的机械强度、弹性和缓释性能大大提高。

背景技术

采用传统的游离微生物技术修复受PAHs污染的土壤时存在一些缺陷，如单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、与土著菌竞争处于劣势、抗毒性侵害能力差、对环境条件敏感，加入到修复现场环境中的微生物可能由于竞争或难以适应环境而导致作用结果与实验结果有较大出入，使得不能很好的应用于原位污染土壤修复。而固定化微生物技术有望克服这些缺点和弊端。

固定化微生物技术(IM)是利用化学或物理的手段，将游离的微生物定位于限定的空间区域使其保持活性并能反复使用的一种技术。固定化方法很多，由于包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都较高，且应用灵活，是最为实用方便的固定化方法。

包埋固定化是使微生物包埋在半透明的聚合物或膜内，或使微生物细胞扩散进入多孔性的载体内部，小分子底物及代谢物可自由出入这些多孔或凝胶膜，而微生物细胞却不能移动。尽管包埋固定化法已经广泛应用于修复污染的流体介质，但在修复污染的非流体介质中应用该技术还未见成功的实例。主要原因：一方面是因为非流体介质本身所具有的复杂性和特殊性给该技术提出了许多不同于在流体介质中应用该技术时所面临的科学问题，如固定化微生物颗粒的载体如何选择，如何克服在非流体介质中固定化颗粒的不可回收性，如何克服污染物浓度的非均质性对固定化颗粒造成的冲击；如果提高固定化颗粒的机械强度以抵抗环境胁迫造成的物理损伤；另一方面是包埋法本身存在的缺陷，如：颗粒的扩散传质性能差、空隙不均匀、抗温度变化和酸碱度变化能力弱等。此外，传统的采用Na·Alg固定化方法常常对应单一菌种，缺乏广谱适应性，对其他属菌株的固定不利。

耐用廉价的微生物固定化载体或包埋材料的研究和开发已成为进一步降低处理成本、促进技术推广应用的关键。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出一种用于修复多环芳烃污染土壤的包埋固定化载体配方及其工艺。本发明以海藻酸钠(Na·Alg)为主体载体材料，以活性炭、泥炭土、红砖粉、粉煤灰等材料为辅助载体，改进了传统的Na·Alg包埋固定化工艺，使固定化条件更加简化和温和，提高了固定化颗粒的多种技术指标(性能更加优良)，并可对多种不同属微生物进行固定化。将制得的固定化微生物应用于多环芳烃污染土壤的修复，结果表明：按照该配方制得的固定化生物产品机械强度高，对高分子量多环芳烃污染土壤具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物产品。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种微生物固定化包埋颗粒的制备方法，

按照重量5-20％的比例将培养12～14h的种子液与凝胶液混匀，在25-40℃和pH自然条件下，通过直径为1-4.00mm的制粒器，按照20～30滴/min的流滴速度制得固定化颗粒，颗粒经10～18h化学交联，然后在固定剂中静置加固23～58h，最后以无菌水浸泡24-72h，冲洗净残留药液后，增殖培养，备用；

凝胶液质量百分配比为：海藻酸钠(Na·Alg)2～3％，(150目)活性炭、红砖粉、泥炭土和/或粉煤灰0.3～0.6％，余量为水。

凝胶液配制过程为：以所需自来水重量的20％浸润Na·Alg凝胶剂12～20h，100-110℃高温加热，完全溶解后冷却到35～45℃，再向凝胶液中添加定量辅助载体，定容，使用前于110℃下湿热灭菌30min，冷却到35～45℃，备用。

所述交联剂质量百分配比为：质量百分比为4％的CaCl₂溶液，pH值自然或4％CaCl₂～饱和硼酸溶液，pH值自然；

加固剂质量百分配比为：a.壳聚糖1.0％水溶液，先用微量浓HCl溶解后再加水定容，pH自然；b.0.6mol/L乙二胺水溶液，pH自然；或c.4％PVA水溶液，pH自然。

增殖培养过程为，将制备的固定化颗粒再无菌条件下按照20～25％的质量浓度加入增殖培养基中，控制温度在28～30℃，摇床转速130rpm～150rpm，培养时间24h，之后更换培养基，共3次培养，备用。

细菌的菌体培养基为：

基础培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，1.5～2.0％琼脂，pH 7.0～7.2；