[发明专利]可定向克隆启动子并研究其活性的T载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种载体构建的方法，特别是一种高通量可直接定向克隆启动子并研究启动子功能的T载体构建方法。

背景技术

T载体是用于直接克隆PCR产物的线性载体，A-T克隆技术被证明对PCR产物的克隆极具价值。此方法的原理是利用Taq DNA聚合酶可向扩增产物的3’端多加一个非模板依赖的dA碱基，此dA刚与线性T载体3’突出端的dT配对，直接进行高效率的连接，而无需限制性内切酶酶切的过程。

在启动子研究领域中，启动子的PCR扩增产物往往需要克隆到带有报道基因如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(luciferase)或分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的载体中，常规的方法是通过亚克隆完成，即首先将PCR产物克隆至传统克隆型T载体，之后采用限制性内切酶切割下目的基因片段，再将其亚克隆至无启动子的报告基因载体。然而这种方法有两个缺点：一是亚克隆的效率受到酶切效果、目的基因回收质量、得率和连接效率等诸多因素的制约；二是在启动子的研究过程中，通常片段愈长，其含有的限制性内切酶位点就愈多，在克隆过程中必然会受到酶切位点选择的限制问题。这种矛盾在进行高通量筛选启动子时显得尤其突出。它可以通过制备直接用于启动子克隆和功能分析的T载体而得到解决。目前尚无商品化的启动子分析性T载体。

pEGFP-1是用于研究启动子活性的载体，其中报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)由于荧光性质稳定，荧光强度高，对细胞无毒性，检测方便，广泛用于启动子的研究中。该载体具有原核和真核的复制起始点如pUC、f1和SV40的复制起始点，同时具有卡那霉素(Kana)抗性基因和新霉素(Neo)抗性基因作为筛选标记，EGFP基因序列位于其多克隆位点的下游。pGL3-basic和pSEAP2-basic是另2种常用的启动子分析载体，分别以luciferase和SEAP作为报告基因，都具有氨苄青霉素(Amp)抗性基因作为筛选标记。

目前，经典的T载体的构建方法有2种。第一种方法是先将质粒通过SmaI或EcoRV等产生平端切点的内切酶线性化，然后利用末端转移酶或具有末端转移酶活性的Taq酶在dTTP或ddTTP环境中实现T的添加(Papp T，Kirchner S，Diener U，Jafari，M，GolkaA，SchiffmannD，1995.Cloning of PCR fragments with a modified M13mp18 T-vector.Trends Genet.11，169)。第二种方法是限制性内切酶酶切的方法，首先制备前T载体，即在出发载体中引入2个串联的能产生3’突出单碱基末端的限制性内切酶如XcmI、AhdI(或它们的同裂酶)等的识别位点，称为XcmI盒、AhdI盒，这些酶切割特异性序列后产生的末端为3’突出单碱基N(任意碱基)，如果将该碱基设计为T，则可以通过酶切前T载体使其产生2个3’突出T碱基而成为T载体(Vries E.，1998.A vector for direct cloning of PCR products in a double Xcm I restriction siteoffering compatible single 3’overhanging T residues.Mol Biotechnol.10,273)。

目前就T载体的制备方法来讲，存在着不足之处，主要表现在以下两个方面：

一、非重组背景较高，克隆效率低下。

末端转移酶或Taq酶制备T载体有时由于酶加T的效率低下，有些载体分子末端根本没被修饰从而导致两端均未加T的平端线性质粒的存在，在连接过程中难以避免载体自身环化，有时也存在线性质粒在加T尾过程中其两端的序列被部分删除的问题。

采用XcmI、AhdI等限制性内切酶制备T载体的方法也会因为酶切效率相对较低，经常产生酶切不完全的现象，出现克隆过程中非重组背景过高的问题。目前解决这一问题最有效的方法是在前T载体的两个XcmI或两个AhdI酶切位点之间引入足够长的间隔DNA，经琼脂糖电泳后将完全酶切的质粒和部分酶切的质粒分开。然而，引入间隔DNA带来的一个新问题是：由于环型超螺旋质粒在琼脂糖凝胶电泳中比分子量相当的线性质粒涌动快，因此完全未被酶切的环型超螺旋前T载体往往与分子量小于它的T载体(完全切开)混杂，因此造成非重组转化子的本底较高，如果前T载体缺乏区别于T载体的筛选标记，就要面临较繁琐的筛选工作。

二、无法实现定向克隆，筛选工作量大。