[发明专利]可定向克隆启动子并研究其活性的T载体及其构建方法

权利要求书

1.一种用于克隆启动子的T载体pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T的制备方法，包括以下步骤：

1)制备含有XcmI盒(或AhdI盒)的前T载体pEGFP-UC、pGL3-UC和pSEAP2-UC，所述XcmI盒包括间隔DNA序列，紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个XcmI酶切位点序列；

2)用XcmI酶或XcmI酶的同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体；其特征在于：所述步骤1)中的间隔DNA序列为带有与出发载体具有不同抗性基因或其它选择标记的序列，如构建前T载体pEGFP-UC时所采用的质粒pUC18全序列和构建前T载体pGL3-UC与pSEAP2-UC时所采用的pUC-K序列，pUC-K为发明人自行构建的质粒，其特征为以卡那霉素抗性基因取代pUC18中的氨苄青霉素抗性基因，其余序列与pUC18相同。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述XcmI盒还包括连接于所述各一个XcmI位点的酶切位点序列，即用于前T载体pEGFP-UC制备的BglII和XhoI识别位点或用于前T载体pGL3-UC与pSEAP2-UC制备的MluI和XhoI位点。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述构建前T载体的XcmI盒由PCR扩增得到，根据pUC18和pUC-K的序列设计的PCR引物，序列如下：

pUC-F：5’CGAAGATCTAGACCAAGTTTACTCA-3’；

pUC-R：5’-CAACTCGAGGACAGTTACCAATGCT-3’；

pUC-KF：5’-CGAACGCGTAGACCAAGTTTACTCA-3’。

pUC-F和pUC-R用于扩增pUC18；pUC-KF和pUC-R用于扩增pUC-K。三条引物的5’端分别引入限制性内切酶BglII、XhoI和MluI的识别位点，用单线标示；XcmI酶识别位点用斜体标示；在pUC-F和pUC-KF引物的XcmI识别位点中尚包含稀有限制酶位点PmeI位点的前半部分即GTTT，最后一个T将构成XcmI酶切割得到的3’突出T，用波线标示，用于启动子PCR产物的定向克隆分析。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，启动子扩增引物的设计必须遵循如下原则：将稀有酶PmeI识别位点的后半部分“AAAC”作为下游引物5’端起始碱基，而上游引物5’端不能以“AAAC”起始。PCR产物采用Taq DNA扩增酶扩增，或者采用Pfu、Primestar等高保真酶扩增后再通过Taq扩增酶加A尾。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述出发载体为pEGFP-1的多克隆位点的BglII位点和SalI位点引入所述的XcmI盒，或在所述出发载体pGL3-basic和pSEAP2-basic的多克隆位点的MluI位点和XhoI位点引入所述的XcmI盒。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：用XcmI酶或XcmI酶的同裂酶酶切步骤1中的前T载体，得到T载体，启动子PCR产物与T载体的连接物可在转化之前用PmeI酶切来减少反向连接克隆，提高PCR产物正向克隆效率。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：XcmI盒中作为间隔DNA序列的质粒pUC18或pUC-K全基因序列，具有完整的LacZ’读码框架，通过蓝白斑筛选进一步排除T载体中可能混杂的未被酶切的或单酶切后自身环化的非重组转化子，提高阳性克隆效率。