[发明专利]一种人类核苷酸修复蛋白基因主要多态性位点快速检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域。

背景技术

肺癌堪称第一大癌，已经成为癌性主要致死因素。以DNA损伤为主要机制发挥抗肿瘤作用的铂类药物主要包括顺铂(DDP)、卡铂(CBP)和草酸铂(L-OHP)等，是目前用于治疗晚期肺癌的基本化疗药物，但不同个体对铂类药物敏感性差异很大，从而影响该类药物的临床疗效。研究表明，如果肿瘤细胞DNA修复能力强，这类药物的疗效则差，反之疗效则好。

XRCC1基因是碱基切除修复/单链断裂修复系统中的重要成分，其编码产物与DNA连接酶III相互作用，修复DNA单链断裂，并与DNA聚合酶β一起进行碱基切除修复，对维护基因组稳定十分关键，其编码区R194W、R280H、R399Q多态性影响其生物学活性。研究发现，在XRCC1 R194W表达中，携带R194R基因型患者化疗失败的风险几乎是携带至少一个W等位基因患者的3倍；而携带XRCC1 R399Q或Q399Q基因型的患者对铂类药物化疗失败的风险是R399R携带者的2.7倍；而既携带R194W又携带R399R基因型患者化疗有效率进一步提高，W194W及R399R携带患者化疗有效率则可达80％。因此，通过检测XRCC1基因突变型，可以从晚期肺癌病人中筛选出最适治疗对象进行个体化治疗，从而显著提高药物疗效。

本发明的优势

PCR技术以其自身巧妙的原理有与众不同的特点，高特异性、高敏感性及简便快捷使其成为基因诊断首选的技术之一。

(1)高特异性，PCR扩增严格遵守碱基配对原则的半保留复制。半保留复制是世界上最严格的复制方式之一，其新合成的子链与模板形成完全互补的镜像结构，从而充分保证了复制的准确性。另外，由于碱基互补原则，只有当引物与目的基因完全互补时，反应体系中的引物才能与模板产生复性，引物的延伸才得以进行，因此引物与模板的互补是复制的最基本条件，这从另一方面规定了PCR反应的高特异性。在生物界中，某种基因总有它最保守的、最具特征性的基因区段，它是某些生物，或某些型、亚型等功能分型所特有的。若能正确地选择这一区域作为扩增的目的基因，便可以充分地保障PCR检测的高度特异性。

(2)高敏感性，在PCR反应中模板DNA以指数级迅速增加，扩增反应前期进入以指数级迅速增加，扩增反应后期进入平台反应期，一般经过30个循环即1-2小时内可以将靶序列增加百万倍以上，可以将微量的目标物(fg DNA)检测出来。过去采用的一些微量检测法，如酶联免疫吸附实验(ELISA)和放射免疫分析(RIA)其灵敏度分别为ng级和pg级，而PCR可达fg级，理论上可以检出病原体的单拷贝基因的存在。

(3)简便快捷，Taq酶的使用使PCR技术可以自动化完成，各种高效PCR仪相续问世使PCR操作可以在基层单位的实验室中顺利完成。在PCR的实际应用中，许多技术得到改进，扩增反应体积减少，多种成分预先混合减少加样步骤，这些简化步骤大多不影响PCR的扩增效果。特别是单管单人份的PCR试剂，使操作者节省时间精力，而且又不易污染，充分满足了临床快速诊断的要求PCR技术对样品要求低，不必严格纯化模板DNA，几乎所有的临床样本都能用于PCR扩增。

(4)经济实用，传统的SNP或点突变检测方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-SSO等，大多涉及电泳、酶切、显色及拍照等后处理，操作费时繁琐，特异性和敏感性较差，不能自动化及高通量检测，也容易造成交叉污染，测序及芯片技术则耗时昂贵。本发明结合了PCR及分子探针的特性，可精确快速检测XRCC1基因外显子R194W、R280H、R399Q突变，尤其是PCR实时检测技术，可使扩增反应和分子杂交在一个封闭的系统中进行，无须PCR后处理步骤，避免了污染，并能分辨单碱基差异，灵敏度高，操作简便快速，适于大批量样本的检测，整个检测可在2小时完成。我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。现时各大中小医疗机构基本上均配置了荧光PCR仪，本发明具有极广阔的应用前景。

发明内容

本发明提供一种人类核苷酸修复蛋白基因主要多态性位点快速检测方法及试剂盒，其特征采用PCR分别扩增人类染色体XRCC1基因外显子包含R194W、R280H、R399Q突变位点的基因序列，应用分子荧光探针与扩增产物杂交，应用荧光PCR仪实时测量PCR过程中反应液的特征性荧光信号强度变化，或PCR后应用荧光分光光度仪测量反应液的特异荧光强度，进行结果判断。