[发明专利]一种丙酮酸氧化酶基因、其重组表达质粒及转化的菌株

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种绿色气球菌(Aerococcus viridansATCC10400)来源的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD，其重组表达质粒，及重组表达质粒转化的大肠杆菌基因工程菌株。

背景技术

已发现的丙酮酸氧化酶可分为两类，一类丙酮酸氧化酶(EC.1.2.2.2)在催化转化时不以氧分子为直接受体，不产生过氧化氢，催化反应为：

丙酮酸+亚铁细胞色素b₁+H₂O＝醋酸盐+CO₂+亚铁细胞色素b₁；

大肠杆菌丙酮酸氧化酶就是一个代表。

另一类丙酮酸氧化酶(EC.1.2.3.3)以氧分子为直接受体，产生过氧化氢，催化反应为：

丙酮酸+磷酸盐+O₂+H₂O＝乙酰磷酸+CO₂+H₂O₂；

来自乳酸杆菌属、链球菌属、绿色气球菌及白色念球藻属的丙酮酸氧化酶则属于此类。

临床生化检验中广泛使用的是丙酮酸氧化酶(EC.1.2.3.3)。

丙酮酸氧化酶(EC.1.2.3.3)在临床生化检验中用途广泛，可用于丙酮酸、丙酮酸激酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、无机磷酸、唾液酸、唾液酸激酶的酶活性及尿素的检测。

基因工程是高效表达和大量生产丙酮酸氧化酶的有效手段。1984年Charlotte Grabau等首次克隆了大肠杆菌丙酮酸氧化酶基因poxB(Charlotte Grabau et al.Journal ofbacteriology，Dec.1984，p.1088-1092)；1986年Ying-ying Chang等克隆了大肠杆菌丙酮酸氧化酶突变基因poxB3和poxB4(Ying-ying Chang et al.Journal of bacteriology，July 1986，p.312-318)。1992年美国专利5096821报道了来自Lactobacillus plantarum(DSM 2571)菌株的突变型丙酮酸氧化酶基因的表达(US Patent 5096821 Schumacher，et al.March 17，1992)；1994年Kopetzki等以基因工程手段对Lactobacillus plantarum丙酮酸氧化酶蛋白肽链结构进行了改造，在酶蛋白肽链N端添加Met-Thr-Met-(His)₃结构，构成金属螯合尾，使重组酶通过金属亲和柱分离纯化(Erhard Kopetzki，et al.CLIN.CHEM.40/5，688-7041994)；2004年Fre′de′rique Lorquet等克隆了Lactobacillus plantarum的丙酮酸氧化酶基因poxB，构建的Lactobacillus plantarum工程菌其表达的丙酮酸氧化酶的活力可达2.1U/mg(Fre′de′rique Lorquet，et al.Journal of bacteriology，June 2004，p.3749-3759)；2001年，侯本祥等(侯本祥等华西医大学报2001；32(1)：15～17)成功地从血链球菌ATCC10557扩增出血链球菌丙酮酸氧化酶基因(Sopox)，并在大肠杆菌JM105中得到表达，所表达的目的产物占总菌体蛋白的25.46％。但该研究不是以制备生化检验用的丙酮酸氧化酶为目的，所提供的基因工程菌株高产丙酮酸氧化酶主要用于牙周病的防治研究。

美国专利4246342(US Patent 4246342 Misaki，et al.January 20，1981)报道利用野生型绿色气球菌(Aerococcus viridans IFO-12219，Aerococcus viridans IFO-12317)进行发酵生产丙酮酸氧化酶，丙酮酸氧化酶的产量仅为46～52U/L。绿色气球菌丙酮酸氧化酶(AvPyOD)基因工程菌株的构建至今尚未见到报道，本发明是首次报道绿色气球菌丙酮酸氧化酶(AvPyOD)基因工程菌株的构建及表达。