[发明专利]突变青霉素G酰化酶、其重组表达质粒及转化的工程菌株

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及通过基因定点突变方法获得合成性能提高的青霉素G酰化酶的基因、突变质粒、工程菌以及突变酶。

背景技术

青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase，E.C.3.5.1.11，简称PGA)是一种异二聚体N-端亲核丝氨酸水解酶(Duggleby et al.，Nature，373(6511)，264-268，1995)。青霉素G酰化酶是半合成β-内酰胺类抗生素工业的重要用酶，该酶主要用途在于分别水解青霉素G和头孢菌素G，生成相应的化合物母核，6-氨基青霉烷酸(6-AminoPenicillinic acid，6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-Amino-deacetoxy-cephalosporanic-acid，7-ADCA)(Abian et al.，Biotechnol Prog，2003，19(6)，1639-42，2003)。青霉素G酰化酶的新用途是催化母核6-APA或7-ADCA与各种D-氨基酸发生侧链反应，生成新的半合成β-内酰胺抗生素，如半合成青霉素和半合成头孢霉素等(Gabor，De Vries，and Janssen，Enzyme And MicrobialTechnology，2005，36(2-3)，182-190)。

酶法合成β-内酰胺抗生素研究开始于上世纪60年代。相对于化学法(Wegman et al.，Advanced Synthesis & Catalysis，343(6-7)，559-576，2001)，由于其具有不用有机溶剂、反应条件温和以及环保等优点，酶法合成β-内酰胺抗生素逐渐成为了β-内酰胺抗生素工业研究中的一个热点(Giordano，Ribeiro，and Giordano，Biotechnology Advances，24(1)，27-41，2006)。理论上，β-内酰胺类抗生素的酶法合成可通过两种方法(Kasche.Enzyme andMicrobial Technology，8(1)，4-16，1986)，即1)热力学控制，即逆转水解反应，和2)动力学控制，即酰基转移，实现。动力学控制的催化机制，涉及酶和酰基供体反应，形成酰基酶中间体，当中间体遇到β-内酰胺母核即可发生耦合，形成半合成β-内酰胺抗生素；而水作为竞争性亲核性试剂，引起反应物和产物的水解，当产物合成速率与产物水解速率相当时，该合成产物量达到最大值。

近年来，利用酶法催化动力学控制母核6-APA或者7-ADCA的酰基化的研究已有所报道(Bruggink，Roos，and de Vroom.Organic Process Research & Development，2(2)，128-133，1998)。与传统的化学合成法比较，β-内酰胺抗生素的酶法合成面临的主要问题，是在合成抗生素的同时又发生两个副反应，即1)水解活化的酰基供体；2)水解生成的抗生素；从而导致酰基供体和生成的抗生素的减少，进而造成了母核转化率偏低，即合成产物/水解产物(S/H)的比值偏低。虽然可以通过改善该酶促反应的反应条件，例如pH值优化(Nam，Ryu，and Ryu.Journal Of Microbiology And Biotechnology，11(2)，329-332，2001)，采用过饱和的底物和改变各种反应底物的投料比(Youshko et al.，Biotechnol Bioeng，85(3)，323-9，2004)，以及媒介工程改造(Fernandez-Lafuente，Rosell，and Guisan.，Biotechnol ApplBiochem，24(Pt 2)，139-43，1996)等，来改善上述问题，但是酶自身的特性对S/H值的影响依然是最重要的(Alkema et al.，Eur.J.Biochem，270(18)，3675-83，2003)。