[发明专利]一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物医学检验领域，涉及微生物分子生物学检测方法，具体涉及一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒。

背景技术

近年来，结核病在全球呈现明显回升趋势。除HIV感染之外，耐多药结核病成为全球结核病回升的主要原因之一。多重耐药结核病的主要治疗策略是避开应用结核杆菌耐药的抗结核药物，这就要求能快速得到耐药资料，但目前的传统培养与药敏测定方法往往需要1个月后才能得到耐药性资料，如果培养阴性则根本不能得到耐药性资料。建立一种快速检测结核菌感染以及检测耐药性的方法，是结核防治工作的迫切需要。

传统的结核分支杆菌耐药性的检测，依靠培养法进行药敏试验，是体外结核分支杆菌耐药性的直接证据，但耗时长达1～2个月。近年来，一些新的药敏试验方法已用于耐药菌株的测定，但能将测定时间控制在1-2天者仍少见。目前已用于或有可能开发为耐药表型快速检测技术的主要有：Bactec呼吸测定与分支杆菌生长指示管法(MGIT)；2、流式细胞仪测定法(FCM)；3、噬菌体发光法与噬菌体裂解法。

目前治疗结核的一线药物主要包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、吡嗪酰胺等。这些药物作用的靶位、导致抗性产生的基因突变位点已基本清楚，这是进行耐多药基因型检测的基础。目前临床检测多采用PCR方法直接对标本中的结核杆菌抗性相关基因进行扩增，与野生株(药物敏感株)进行比较，检测是否发生突变，从而判断是否产生相应的抗性。目前常用的分析方法有DNA序列分析、异源双链分析、固相杂交分析法和单链构象多态性(SSCP)分析、线性探针杂交(LiPA)方法等。这些方法均较快速，1～2天就可出结果，但均未能同时对多种耐药基因型进行检测，若对多种耐药基因型分开检测成本势必大大上升，难以在临床上推广应用。

在所有目前分子生物学技术中，线性探针杂交(LiPA)方法是操作性最强与成本相对较低的技术，目前该技术仅用于检测单个药物的耐药基因型；基因芯片是耐药基因型检测技术中的佼佼者，具有快速、高效地分析生物信息的特点，美国休斯顿现代研究中心(HARC)已研制出了一种DNA芯片，检测利福平、异烟肼、乙胺丁醇3种药物对结核杆菌的耐药性。但基因芯片技术虽然敏感、准确、快速，但成本过于昂贵，临床应用尚有争议。且目前没有成熟的产品；已有研究用等位基因多重PCR方法同时鉴定利福平和异烟肼耐药(①金嘉琳，张文宏等，中华结核和呼吸杂志，2005，28(9)：623-625；金嘉琳，张文宏等，中华传染病杂志，2005，23(3)：146-149)。但所述方法只能检测有限的耐药基因，而且仅能覆盖利福平和异烟肼2个药物，且敏感性不高；有报道应用反向杂交技术进行耐药基因的测定(庞茂银，张文宏，胡忠义，等.中华传染病杂志2004；22(4)：234-236；刘洋，等.中华检验杂志2005；28(4)：394-396)。但该技术目前只能用于检测一种基因而未能对多基因进行同时检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒。本试剂盒可通过一次反应同时多个耐药基因。

本发明的另一目的是提供上述试剂盒的制备方法。

本试剂盒包括可以同时扩增4种结核耐药相关基因的多重PCR体系和可以同时检测所述4种耐药相关基因中相应点突变的探针杂交体系。

本发明联合应用多重PCR技术及核酸杂交技术，首先采用多重PCR(mutiplexpolymerase chain reaction，MPCR)也称复合PCR技术，设计4对特异性的结核分支杆菌(MTB)耐药基因扩增引物，在同一反应体系中同时扩增KatG、embB、rpsL及rpoB四种最常见的易发生突变的MTB耐药基因，PCR扩增产物再利用Southern Blot技术分别对四种基因的突变位点进行检测，从而达到“一次扩增，多次杂交”的快速检测之目的。

鉴于当前的反向杂交技术是基于单纯PCR的杂交技术，只能检测一个耐药基因，本发明试剂盒基于多重PCR的技术，通过一次反应同时检测多个基因；其次，当前的反向杂交技术只能检测一个基因的不同耐药位点，而不能对多个基因同时检测，本发明则能同时检测多个耐药基因，实现快速检测结核分支杆菌多重耐药性的目的。

本发明试剂盒通过下述方法和步骤制备：

1、利用多重PCR技术，设计4对特异性的结核分支杆菌(MTB)耐药基因扩增引物，在同一反应体系中同时扩增KatG、embB、rpsL及rpoB四种最常见的易发生突变的MTB耐药基因，

表1是引物序列及扩增产物耐药基因包含的易突变位点。

表1