[发明专利]一种采用酶法拆分制备L－酪氨酸－15N的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种外消旋化合物的拆分方法，是一种生化制品的制备方法，尤其是一种采用酶法拆分制备L-酪氨酸-¹⁵N的方法。

背景技术

1846年，Liebig熔融粗的酪蛋白和固体氢氧化钾，再用热水溶解残余物质，添加冰醋酸进行水解后发现了L-酪氨酸。1848年，De La Rue从胭脂虫干标本中分离得到L-酪氨酸并首次正确报道了L-酪氨酸的性质。以后人们从不同的蛋白酸水解液中分离出L-酪氨酸。L-酪氨酸分子式C₉H₁₁NO₃，分子量为181.2，为白色结晶，溶于碱溶液，难溶于水和乙醇，不溶于醚，[α]_D²⁰＝-11.0±0.5°(c＝4，HCl)。L-酪氨酸的结构式如下所示：

L-酪氨酸是典型的中性氨基酸，是芳香族氨基酸，非必需氨基酸，但也是人体不可缺少的一种氨基酸，它是合成神经递质儿茶酚胺的前体，缺乏酪氨酸人体就会出现生长异常，智能低下等现象，因此国内外已普遍开始重视食品中酪氨酸含量的添加。在医药上，L-酪氨酸是合成甲状腺素、多巴、肾上腺素的前体，临床上用于生殖避孕疗效研究，国外，已将L-酪氨酸用于肾脏病患者氨基酸输液以及氨基酸营养液配方中。在饲料工业中常需添加酪氨酸以校正饲料中氨基酸的平衡提高蛋白质利用率，节省蛋白质饲料。化工上，用作腐蚀抑制剂、碱水解反应催化剂、溶解金属铜的溶剂等。¹⁵N-L-酪氨酸作为一种独特的示踪剂在生理医学和生命科学研究中有着广泛的应用，在研究药物在体内的代谢中有着不可替代的作用。

Chemistry of the amino acid，Vol3，1961报道了一种用粗羧肽酶拆分从氯-乙酰-DL-酪氨酸中获得L-酪氨酸的方法。J.Biol.chem.180，473，(1949)报道了一种用氨基酰化酶从氯-乙酰-DL-酪氨酸中获得L-酪氨酸的方法。American Chemical Society，VoL17，No.23，1978报道了一种用羧肽酶拆分从N-三氟乙酰-DL-酪氨酸中获得L-酪氨酸的方法，但采用这些方法获得的L-酪氨酸收率均不高，没有化学纯度的报告，所得产品为天然丰度，所用羧肽酶价格昂贵。采用氨基酰化酶拆分法制备L-酪氨酸-¹⁵N目前国内没有报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足之处而提供一种产品收率高、光学纯度高、化学纯度高、产物的同位素丰度与氮源原料的同位素丰度相比没有降低的采用酶法拆分制备L-酪氨酸-¹⁵N的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种采用酶法拆分制备L-酪氨酸-¹⁵N的方法，其特征在于，该方法步骤如下：

(1)酶反应底物的配制：取一定量的N-三氟乙酰-DL-酪氨酸-¹⁵N，用磷酸盐缓冲溶液溶解后，调节溶液的pH值为4.5～8.0，定容使溶液的浓度为0.01～0.50mol/L作为酶反应底物；

(2)保温反应：按照每克底物加入1～10g游离米曲霉菌体细胞或0.01～0.5g氨基酰化酶酶粉的比例将游离的米曲霉菌体细胞或氨基酰化酶酶粉加入(1)中配制好的酶反应底物中，在30～50℃、一定的摇床转速下，保温反应10～50小时；

(3)萃取：保温反应结束后反应液用盐酸调pH至1～3，用等体积的乙酸乙酯错流萃取1～4次；

(4)脱色：萃取后的水相经减压浓缩至一定体积，加入适量的活性炭脱色；

(5)脱色液浓缩至一定体积后，用稀盐酸和稀NaOH调pH至等电点，在0～4℃下过夜，再用冰水洗去杂质，过滤后烘干即得L-酪氨酸-¹⁵N产品。

所述的底物浓度为0.02～0.30mol/L较佳。

所述的底物pH为5.0～7.0之间较佳。

所述的游离米曲霉菌体细胞的加入量为每克底物1～8g较佳。

所述的氨基酰化酶酶粉的加入量为每克底物0.03～0.2g较佳。

所述的调节溶液的pH值采用稀NaOH、LiOH、氨水中一种与盐酸或醋酸调节。

所述的保温反应温度为30～40℃较佳，反应时间为10～40小时较佳。

所述的保温反应的摇床为水浴摇床，该摇床转速为100～150转/min。