[发明专利]人脐带间充质干细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的 一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点而日益受到人们的关注：(1)多向 分化潜能。在体内/外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神 经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可 作为理想的种子细胞用于组织工程。(2)造血支持和促植入。作为造血微环境主要细胞成分 ——基质细胞系的干/祖细胞，MSCs通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多种细 胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干祖细胞的生长。与造血干细胞共同移植可促进 造血干祖细胞的植入，对于提高脐血移植成功率，拓宽脐血移植适用范围具有重要意义。(3) 免疫调控。MSCs表达MHC-I类分子，不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可 抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的 移植物抗宿主病，诱导器官移植免疫耐受有较好的应用前景。(4)自我复制。MSCs作为干细 胞可以自我复制，体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，在基因治疗中 有着十分诱人的前景。

目前MSCs的主要来源为成人骨髓，但成人骨髓源MSCs细胞数量及增殖分化潜能随年龄 的增大而下降，病毒感染率较高，且供者MSCs的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制，寻 找新的MSCs来源是目前国内外干细胞研究的热点。研究发现，MSCs在人胎儿和生后多种组 织广泛存在，包括骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝、脐血和脐带等。关 于脐血MSCs的报道存在较多争议，且脐血MSCs的分离会损失脐血中造血干祖细胞，影响脐 血冻存。脐带来源广泛，便于取材，对供者无不利影响，无道德伦理问题的限制，且脐带可 望作为自体MSCs来源于脐血共同移植提高脐血移植成功率，因此，脐带MSCs有望成为骨髓 MSCs的理想替代来源。新近Yuri A等提出脐带中MSCs存在于内皮和内皮下，可采用内皮 消化法从胎儿脐带中分离出MSCs。但采用内皮消化法，只有30％的脐带标本可以得到MSCs， 70％的标本不能得到可多次传代的MSCs。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效的人脐带间充质干细胞的制备方 法。

本发明的技术方案概述如下：

一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是由下述步骤组成：

(1)将人脐带去除残留血液，剪碎，用胶原酶消化；(2)再加入胰酶消化；(3)消化液用 筛网过滤，去除未消化组织；(4)将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释；(5)离心，获得 细胞；(6)将细胞接种于培养基内进行培养，得到大量人脐带间充质干细胞。

人脐带剪碎最好是0.05-1.5mm³的小块。

加入胶原酶的重量为原料重量的0.05％-0.2％，优选的是0.1％，消化温度为37℃，消化 时间为30-60分钟，优选的是45分钟。

加入胰酶(Sigma，USA)的重量为原料重量的0.05％-0.2％，优选的是0.125％，消化温 度为37℃，消化时间为30-60分钟，优选的是45分钟，在消化过程中可以选用转子搅拌。

筛网可以前后用100目、200目筛网。

将过滤后的消化液用磷酸缓冲液(PBS)稀释，消化液与磷酸缓冲液的体积比为1：8-12， 最好是1：10。

在离心时，离心机的转速为1000转-2000转/分钟，转10-20分钟，优选1500转/分钟， 转15分钟。

细胞接种的培养基为无血清培养基。

本发明的优点：

本发明的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，操作简单易行。90％足月脐带可以分离 出丰富的MSCs，且可在5周扩增得到1×10⁹MSCs细胞，本方法得到的脐带MSCs可在体外大 量扩增，可满足临床和实验研究的需要。

附图说明

图1为MSCs的细胞形态；

图2为脐带来源的MSCs的细胞生长曲线；

图3为脐带来源的MSCs的细胞周期分析；