[发明专利]基于磁性纳米粒子的单核苷酸多态性(SNP)检测方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种应用磁性纳米粒子的基因检测技术，尤其是一种单核苷酸多态性(SNP)的检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性是指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化，而且其中最少一种等位基因在群体中的频率不少于1％。虽然遗传密码由4种碱基组成，SNP通常是一种二等位基因(biallelic)，或二态的遗传变异，即在该位置上存在两种不同的碱基。随着人类基因组测序工作的完成，SNP的筛选及其检测正成为研究者们广泛关注的焦点。研究与遗传表型相关的DNA序列变异是遗传学研究的主题之一，人类基因组序列的变异大多数是单核苷酸的突变，而且在不同的人群中，SNP的频率分布有差异，这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。因此，研究SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。另外，比较物种间SNP的差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物学信息。SNP的应用前景广泛，因此，对SNP检测方法的开发具有时间上的紧迫性。

近年来，国内外有关SNP分型检测技术正成为研究热点，新的SNP检测方法层出不穷，如以分子构象不同为基础的检测方法，包括测序法、单链构象多态性分析、限制性长度多态性分析、变性高压液相色谱等；以荧光共振能量传递，包括Taqman法、分子信标(molecular beacons)法、侵入法(Invader assay)等；此外还有以分子杂交技术为基础的检测方法，包括等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、动态等位基因特异性杂交法、寡核苷酸连接法，基因芯片法等；除了以上三大类方法以外，还有如质谱法、AFM法单个碱基延伸标记法。

目前，SNP与复杂疾病的遗传易感性已经成为的SNP研究重点。而要进行这方面的研究，就需要能够简便地确定SNP的基因型在年龄、种族相匹配的病人和对照人群中的发生频率，因此要对大量的样本的待检测SNP位点进行快速、低成本的基因分型。现有的各种SNP检测方法试图能够对样品实施快速、准确的基因分型，但这些方法还存在各自的不足之处。如基于分子构象不同的检测方法，其方法只能检测到突变，但不能给出序列信息，而无法确定具体突变位点与突变形式，且不易实现高通量检测，难以满足现实需要。而以荧光共振能量传递和以分子杂交技术为基础的各种检测方法，尤其以分子杂交技术为基础的基因芯片法，能够高通量对大量样品分型，但是操作过程中需要对待检测靶序列进行纯化、浓缩，这样既费时、费力又增加了成本，难以满足SNP在相关研究以及临床中的应用。因此，探索和建立高效、快速、高通量且适合于临床应用的SNP检测方法是十分必要的。

随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。磁性纳米粒子(MNPs)作为纳米材料的一个重要组成部分，由于其特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA的检测等。磁性钠米粒子在溶液中较好的扩散型，高的表面积以及特殊的磁分离性质使其在核酸检测方面具有非常广阔的应用前景。

发明目的

本发明的目的是为了提供一种利用磁性纳米粒子做为载体针对基因组中单核苷酸多态性位点(SNP位点)进行分析的SNP分型检测方法，该方法利用了磁性纳米粒子的优点，克服了现有技术中对待检测靶序列进行纯化、浓缩而导致的成本高、费时、费力等缺陷，从而具有简便、高效、准确地对大量样品进行SNP分型的优点。

发明内容

本发明的目的通过下述方案实现：

基于磁性纳米粒子的SNP分型方法，包括下述步骤：

(1)选取待检测的重要功能SNP位点。设计一对扩增引物，其中一条引物一端标记生物素。

(2)针对步骤(1)中选取的SNP位点，设计两条分别与两种等位基因互补的野生和突变检测探针，待检测位点位于探针序列的中间且每条探针的一端带有标记物。

(3)在96或者384孔PCR板中通过PCR扩增出包含有待测SNP位点的靶序列，然后加入适量的亲合素化的磁性纳米粒子，通过亲合素-生物素间共价结合，将扩增出的产物固定在磁性纳米粒子上，构成磁性纳米粒子-DNA复合物。

(4)上述步骤(3)磁性纳米粒子-DNA复合物变性、洗涤后于步骤(2)中的检测探针杂交，野生纯合型样本只与野生探针匹配，突变纯合型样本只与突变探针匹配，杂合型样本与两种探针均匹配。

(5)将杂交有检测探针的磁性纳米粒子经洗涤、变性、磁分离后，通过检测变性下来探针上的标记物来实现对样本的SNP分型。