[发明专利]一种应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法。

背景技术

传统的单克隆抗体开发路线是从获得单一的纯化抗原开始，经过免疫等过程得到针对此抗原的单克隆抗体，这样得到的单克隆抗体并不能知道其所针对的抗原的表位(抗原决定基)。而要想得到明确抗原决定基的抗体，传统路线只能通过化学合成小片段多肽，并经化学偶联载体后进行动物免疫制得。这种方法只能一次制备一种抗体。如CN03131796.0号专利文献公开了一种利用噬菌体展示技术展示抗原制备抗体的方法。该方法是将已知抗原的基因插入噬菌体基因内，然后展示在噬菌体表面，构建噬菌体抗原库，将此融合噬菌体颗粒作为免疫原进行动物免疫，制备抗体，是针对cTnI蛋白的抗体。这种方法有一定的难度和复杂性，需要进行基因工程的操作，抗原不是天然的混合抗原(如完整细胞)，不能在一次免疫得到的大量单克隆抗体后进行的抗原筛选鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以快速开发出数百种单克隆抗体并确定它们各自针对的抗原决定基的应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法。

本发明方法包括以下步骤：

一、应用混合抗原免疫动物；

二、按常规方法制备杂交瘤细胞；

三、应用噬菌体文库进行筛选：将杂交瘤分泌的抗体包被在ELISA板上，加入噬菌体文库，洗掉不能结合的噬菌体；

四、鉴定特异性噬菌体：将结合的特异性噬菌体洗脱，并感染细菌，放大和提取菌体里面的含有外源基因片段的载体，通过DNA序列分析鉴定出该抗体针对的抗原。

所述方法中：

步骤一进一步是指，混合抗原采用细胞，培养细胞到浓度为1×10⁶~7×10⁷/mL，用注射法进行动物免疫；最好采用消减免疫法进行动物免疫，将正常细胞免疫动物，之后注射免疫抑制剂(如：环磷酰胺)，之后再将另一种细胞(如肿瘤细胞)免疫同只动物。

步骤二进一步是指，取免疫动物脾细胞，制备成单细胞与事先培养好的骨髓瘤细胞融合，筛选、克隆化杂交瘤细胞。

步骤三进一步是指，将杂交瘤细胞分泌的上清包被在96孔板中，加入文库进行筛选：

(一)淘选

每个事先包被了抗体的孔内加入一份原始文库，孵育，移去用毕的文库，加入洗涤液洗涤；

(二)回收吸附的噬菌体

每孔中加入TG1细胞悬液，孵育后，立即置冰上，收集细胞；

(三)噬菌体的富集

1)、加入培养基到富集的TG1细胞，振荡；

2)、加入氨苄后，加入噬菌体M13K07，振荡；

3)、离心，弃上清；

4)、将细胞重新用加了氨苄和卡那的培养基悬浮，振荡；

5)、离心，将上清转移至另一管；

6)、再离心，将上清转移至另一管；

7)、加入阻断液，孵育；

8)、加入PEG，孵育以沉淀噬菌体；

9)、再离心，弃上清，沉淀用缓冲液再悬浮，离心，收集上清；

(四)为ELISA筛选制备噬菌体克隆

1)、挑取上述分离好的单克隆于标记有“PC1+克隆号”的离心管内，加入培养基，振荡，即为PC1；

2)、将PC1培养物转移到标记有″PC2+克隆号″的管中，加入含有辅助噬菌体M13K07的培养基，振荡；

3)、离心，弃上清，用培养基重悬浮细胞，振荡，即为超感染的单个噬菌体克隆PC2；

4)、纯化噬菌体克隆：

a、离心，转移上清到标记有″PC3+克隆号″的管中，加入阻断液，培养；

b、加入PEG，培养；

c、离心，弃上清，用缓冲液悬浮细胞。这就是纯化后的噬菌体克隆，即PC3；

最好(一)至(三)反复进行3至4次。

步骤四进一步是指，鉴定特异性抗原，包括：

(一)ELISA筛选

1)、加PC3噬菌体到包被了抗体的ELISA板孔中，孵育；

2)、移掉噬菌体悬液，用洗涤液洗，每孔加pVIII抗体，孵育后，移除，洗涤；

3)、每孔中加入标记的二抗，孵育后，移除二抗，洗涤；

4)、每孔加入显色剂，孵育直到变色；

5)、每孔中加入终止液停止显色反应，读取吸光率；

6)、根据ELISA的结果，选出PC1或PC3克隆；

(二)分析阳性克隆

1)、消除非特异性克隆；