[发明专利]一种应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法

权利要求书

1.一种应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法，其特征是包括以下步骤：

一、应用混合抗原免疫动物；

二、按常规方法制备杂交瘤细胞；

三、应用噬菌体文库进行筛选：将杂交瘤分泌的抗体包被在ELISA板上，加入噬菌体文库，洗掉不能结合的噬菌体；

四、鉴定特异性噬菌体：将结合的特异性噬菌体洗脱，并感染细菌，放大和提取菌体里面的含有外源基因片段的载体，通过DNA序列分析鉴定出该抗体针对的抗原。

2.根据权利要求1所述的应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法，其特征是步骤一所述的应用混合抗原免疫动物是指：混合抗原采用细胞，培养细胞到浓度为1×10⁶~7×10⁷/mL，用注射法进行动物免疫。

3.根据权利要求1所述的应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法，其特征是步骤二所述的按常规方法制备杂交瘤细胞是指：取免疫动物脾细胞，制备成单细胞与事先培养好的骨髓瘤细胞融合，筛选、克隆化杂交瘤细胞。

4.根据权利要求1所述的应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法，其特征是步骤三所述的应用噬菌体文库进行筛选是指：将杂交瘤细胞分泌的上清包被在96孔板中，加入文库进行筛选，包括：

(一)淘选

每个事先包被了抗体的孔内加入一份原始文库，孵育，移去用毕的文库，加入洗涤液洗涤；

(二)回收吸附的噬菌体

每孔中加入TG1细胞悬液，孵育后，立即置冰上，收集细胞；

(三)噬菌体的富集

1)、加入培养基到富集的TG1细胞，振荡；

2)、加入氨苄后，加入噬菌体M13K07，振荡；

3)、离心，弃上清；

4)、将细胞重新用加了氨苄和卡那的培养基悬浮，振荡；

5)、离心，将上清转移至另一管；

6)、再离心，将上清转移至另一管；

7)、加入阻断液，孵育；

8)、加/入PEG，孵育以沉淀噬菌体；

9)、再离心，弃上清，沉淀用缓冲液再悬浮，离心，收集上清；

(四)为ELISA筛选制备噬菌体克隆

1)、挑取上述分离好的单克隆于标记有“PC1+克隆号”的离心管内，加入培养基，振荡，即为PC1；

2)、将PC1培养物转移到标记有″PC2+克隆号″的管中，加入含有辅助噬菌体M13K07的培养基，振荡；

3)、离心，弃上清，用培养基重悬浮细胞，振荡，即为超感染的单个噬菌体克隆PC2；

4)、纯化噬菌体克隆：

a、离心，转移上清到标记有″PC3+克隆号″的管中，加入阻断液，培养；

b、加入PEG，培养；

c、离心，弃上清，用缓冲液悬浮细胞。这就是纯化后的噬菌体克隆，即PC3。

5.根据权利要求1所述的应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法，其特征是步骤三所述的鉴定特异性噬菌体是指：鉴定特异性抗原，包括：

(一)ELISA筛选

1)、加PC3噬菌体到包被了抗体的ELISA板孔中，孵育；

2)、移掉噬菌体悬液，用洗涤液洗，每孔加pVIII抗体，孵育后，移除，洗涤；

3)、每孔中加入标记的二抗，孵育后，移除二抗，洗涤；

4)、每孔加入显色剂，孵育直到变色；

5)、每孔中加入终止液停止显色反应，读取吸光率；

6)、根据ELISA的结果，选出PC1或PC3克隆；

(二)分析阳性克隆

1)、消除非特异性克隆；

2)、阳性PC1克隆中在氨苄培养基中培养，分离提取出重组质粒；

3)、用提供的引物对分离出的质粒进行测序。

6.根据权利要求2所述的应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法，其特征是应用混合抗原免疫动物采用消减免疫法进行动物免疫，将正常细胞免疫动物，之后注射环磷酰胺，之后再将另一种细胞免疫同只动物。

7.根据权利要求1所述的应用噬菌体展示文库筛选鉴定单克隆抗体的方法，其特征是应用噬菌体文库进行筛选中的(一)至(三)步骤反复进行3至4次。