[发明专利]重组人卵巢癌抗独特型微抗体高密度发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明提供了一种高密度、高效的重组人卵巢癌抗独特型微抗体表达工艺。

背景技术

卵巢癌发生率占女性生殖系统恶性肿瘤的第2位，死亡率居首位，5年生存率仅20％-40％。随着分子生物学、免疫学等相关学科的发展，具有全身治疗潜能的免疫治疗已成为研究者关注的热点。抗独特型单链抗体由免疫球蛋白重链和轻链可变区组成，分子量小，是抗独特型抗体的最小活性单位，组织穿透力强，体内滞留时间短、清除快、能到达肿瘤的有效部位。但是异源蛋白会引起人抗鼠抗体反应，对鼠源的抗独特型抗体的基因进行各种改造，可减少疫苗中的鼠源成分，并增加分子量，保留其免疫原性。

本发明人工合成人IgG1的铰链区(hinge)和恒定CH3区融合基因(hC)，经体外重组技术，与克隆的人卵巢癌抗独特型抗体6B11的轻链及重链的可变区基因连接在一起，构成完整的人卵巢癌抗独特型微抗体融合基因6B11V_LV_HhC，实现了人源化的改造，并在大肠杆菌中进行了表达，表达产物具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC166-9和识别人免疫球蛋白IgGl的活性，为人卵巢癌抗独特型微抗体的大规模生产奠定了基础。

以阳性克隆建立原始种子库，该种子库的检测表明无外源因子污染，各项生化指标达到要求，表达水平达到要求。本发明提供了一种重组人卵巢癌抗独特型微抗体的新型发酵方法，采用大肠杆菌表达体系以包涵体表达，通过优化发酵工艺，整个过程稳定、快速、简便，获得高密度、高表达水平的重组人卵巢癌抗独特型微抗体。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高密度的重组人卵巢癌抗独特型微抗体的表达方案。包括用于该方案的培养基及诱导条件。

在本发明的第一方面，提供了一种工程菌，其特征在于，它含有编码人卵巢癌抗独特型微抗体的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的工程菌是大肠杆菌。

在本发明的第二方面，提供了一种重组人卵巢癌抗独特型微抗体的中试生产方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，在摇瓶中培养如权利要求4所述的表达载体，从而以包含体形式表达出重组人卵巢癌抗独特型微抗体；

b)在适合的表达条件下，在5L发酵罐中线性放大发酵工艺。

c)在5L发酵罐中优化出最佳中试生产方案。

附图说明

图1中试不同培养基下目的蛋白表达电泳图。1：Marker； 2：诱导前；3：改良M9-4诱导3小时；4：改良M9-4诱导2小时；5：改良M9-3诱导3小时；6：改良M9-3诱导2小时；7：改良M9-2诱导3小时；8：改良M9-2诱导2小时。

图2中试不同起始诱导OD下目的蛋白表达电泳图。1：Marker；2：诱导前；3，4：起始诱导OD600为0.5-1.0；3号罐诱导2～3hr；5～7：2号罐诱导1～3hr；8～10：3号罐诱导1～3hr。

图3不同起始诱导OD₆₀₀下目的蛋白表达电泳图。1：Marker；2～7：诱导1～6小时。

图4不同培养基对高密度发酵的影响。1，6，1：Marke；2～5：改良M9高密度培养基2诱导0～3h；7～10：改良M9高密度培养基1诱导0～3h；12～16：改良M9-4培养基(基本没表达)。

图5不同起始诱导OD₆₀₀对高密度发酵目标蛋白表达影响SDS-PAGE电泳图。1：诱导OD＝5诱导0小时；2：Marker；3～5：诱导OD＝5时诱导1～3h；6～9：诱导OD-10时诱导0～3h。

图6摇瓶中不同培养基下目的蛋白表达电泳图。1：Marker；2，3：1，2号瓶改良M9-4诱导3hr；4，5：3，4号瓶改良M9-3诱导3hr；6：诱导前。

图7摇瓶中不同pH下目的蛋白表达电泳图。1，9：Marker；2，10：诱导前；3：种子液对照；4-8：pH6.0-6.8；11-16：pH7.0-8.0。

图8摇瓶中不同起始诱导OD下目的蛋白表达电泳图。1，10：Marker；9，19：诱导前；2-8，11-18：不同起始诱导OD诱导3小时。

具体实施方式