[发明专利]鲨肝中的小分子RNA及它的用途

说明书

技术领域

本发明涉及从鲨鱼肝脏中提取分离的小分子RNA抗肿瘤的作用，具体是指小分子RNA的提取、分离方法以及小分子RNA体外对SMMC-7721、HepG2等肝癌细胞增值的抑制作用和体内对裸鼠肿瘤生长的抑制作用。

背景技术

鲨鱼是海洋生物资源中重要的物种，鲨鱼软骨中存在抗肿瘤活性物质已有许多报道(鲨鱼软骨抗癌作用研究进展，天津医学，2003，)鲨鱼肝脏约占鲨鱼内赃重量的70％以上。鲨鱼肝脏中有许多活性因子，但有关抗肿瘤的活性物质未见报道，本发明通过体内外试验，证明鲨肝中提取的小分子RNA对肝癌细胞生长的抑制作用。

发明内容

本发明目的是提供从鲨鱼肝脏中提取小分子RNA的方法。

本发明另一目的是提供上述获及的小分子RNA的用途。

本发明是这样实施的：

一、鲨肝小分子RNA的提取、分离、纯化

1.鲨肝小分子RNA的制备：

(1)鲨肝小分子RNA粗提物的制备：

将成熟鲨鱼的肝脏加入到PH为7.2PBS中，高速匀浆，将匀浆液保温15-25’，然后4℃离心，45-60’。取上清、过滤、滤液加入预冷的40％乙醇中(重量百分比)，滤液∶40％乙醇＝1∶6(体积比)再充分搅拌，-20℃过夜，再4℃超速离心，15-25’，沉淀冷冻保存。

(2)FPLC DEAE-Sepharose离子交换层析：

上述冷冻沉淀的鲨肝小分子RNA粗提物用PH为7.8的Tris-cl缓冲液溶解，缓冲液平衡后上DEAE-Sepharose离子交换层析，用NaCl浓度梯度洗脱(A液为20mmol/LpH4.0NaAc-HAC缓冲液，B液为含有1.0mol/L NaCl的A液)，流速每分钟1ml，经280nm紫外检测收集各组分，然后分别测定抑瘤活性以及260nm紫外吸收测定含量并收集活性成分。

(3)FPLC UNO S6离子交换层析

将上述处理后的活性组分上样于PH为4.0醋酸钠一醋酸缓冲液平衡的阳离子交换柱进行离子交换层析，用NaCl梯度洗脱(A液为PH4，NaAC-HAC缓冲液，B液为含有NaCl的A液)流速为每分钟lml，经280nm、214nm双波长紫外检测收集各组分，分别测定抑瘤活性以及260nm紫外吸收测定含量，收集活性组分。

(4)HPLC Protein-Pak^Th125凝胶过滤层析：

上述活性成分冻干后用PH6.5的磷酸缓冲液溶解后进行凝胶过滤层析Protein Pak 125用PH6.5磷酸盐缓冲平衡，以平衡液洗脱，流速每分钟0.5ml经280nm，214nm双波长紫外检测收集各组分，测活。

(5)抑瘤活性测定

人肝癌细胞HepG 2以含10％胎牛血清的MEM(含非必需氨基酸，Earle’s盐)培养基培养，将1×1O⁵/ml的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μl，于37℃、5％CO₂培养箱培养12h，换用无血清MEM培养基继续培养12h，加入鲨肝小分子RNA，补加无血清MEM培养基至200μl，培养24h后，每孔加入1.85×1O⁷[^-3H]-TdR继续培养24h，以0.25％胰酶消化细胞，收集细胞并进行液闪计数。

纯度鉴定

琼脂糖凝胶电泳，胶浓度1％，溴化乙锭(EB)染色。

统计学处理

数据以x±s表示，组间比较采用t检验。

2．鲨肝小分子RNA的分离纯化

(1)鲨肝小分子RNA粗提物用PH7.8Tri-cl溶解，上DEAE-Sepharose弱阴离子柱，NaCl溶液梯度洗脱，得三个峰，DEAE-3峰是活性峰(见图1)，活性测定见表1。

表1  DEAE-3对肝癌细胞HepG2的抑制作用