[发明专利]重组人甲状旁腺素(1～34肽)的串联表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人甲状旁腺素(1～34)肽的方法，包括有关的串联体的获得、工程菌的构建、重组人甲状旁腺素(1～34)肽串联体的表达和相应的纯化工艺。

背景技术

1925年，Collip从牛甲状旁腺组织中分离到甲状旁腺激素，但提取产物不稳定，活性组分不单一，之后Aurbach(1959)用酚抽提获得了均一稳定的产物直到1974年Henry等用酚、三氯乙酸及柱层析才获得纯度很高的产物，并使之用于生物学功能及化学结构方面的研究。

人甲状旁腺素(human parathyroid hormone，PTH)是一种直链多肽激素，由84个氨基酸组成，N端1～34肽段具有完整的生物学功能。

钙在体内对维持肌肉收缩、细胞膜特性、酶活性、骨组织的成熟等方面发挥着重要作用；磷则是遗传物质和细胞膜的重要组分，同时在代谢过程中成为能量转换的媒介。维持钙和磷在体内的相对平衡对机体是十分重要的。甲状旁腺素就是在人体内起调节钙、磷代谢，使血液中钙磷浓度相对稳定的一种因子。甲状旁腺素属多肽激素，由一条多肽链组成，分子中不含半胱氨酸和酪氨酸，分子量为9425，等电点为9.58，含84个氨基酸残基。人血浆中PTH有三种存在形式，除了完整的激素外，还包括分子量约7000和4500两种降解产物。

hPTH通过对肾和骨的作用成为体内最重要的钙磷代谢平衡的调节因子。PTH直接作用于骨，可使Ca2+释放，血Ca2+浓度升高。能促进成骨细胞的消失和破骨细胞的增殖。PTH还作用于肾脏的近球小管，抑制磷的重吸收，增加尿磷的排出，促进肾小管上皮细胞对Ca2+的重吸收，使血Ca2+浓度升高，临床上如果PTH分泌速度过快，就会导致持续的不正常的激素浓度。骨的重吸收代替了骨的形成，导致病理上的甲旁亢。如果PTH的活性片段在较低或中等剂量的浓度下长时间作用于骨，就会刺激骨的形成并且通过诱导骨中的合成作用而有效地治疗骨质疏松症。反之，在甲状旁腺机能减退或缺损时，就会引起肌肉痉挛和手足抽搐。PTH主要是和肾、骨组织中的受体相结合而调节细胞外钙磷的浓度。最初的步骤至少是通过激素受体复合物对于腺苷酸环化酶信号系统的激活，通过增加cAMP的浓度而发挥效应。PTH还通过肾中25-羟-维生素D3转化为活性形式的1，25-二羟-维生素D3的间接作用而保持钙浓度的平衡和骨的形成。PTH还有舒张主动脉，减少外周血管阻力，降低血压，增加输出量的作用。这可能由于影响了细胞膜钙通道Ca2+/ATP酶泵活动，减少了钙的跨膜内流。另外PTH还通过促进心肌细胞穿膜钙内流而对心脏产生作用。因此PTH在生物学及医学方面都受到人们的关注。

随着甲状旁腺激素的发现，人们一直在努力试图大量获得，用于结构功能的研究和骨、肌肉疾病的治疗。起初是从人、猪、牛甲状旁腺组织提取，这种方法提取效率及产量很低。据资料记载。从欧洲及北美许多医院手术切除积累的50g甲状旁腺肿瘤组织中才能获得3.2mg甲状旁腺激素。生物工程技术的兴起及发展使得生物大分子的体外表达成为可能。PTH基因序列的阐明也为建立体外高效表达体系的研究奠定了基础。Born等(1987)将preproPTH基因导人到大肠杆菌中进行了表达，发现prepro序列不能提高PTH的分泌表达，可能是由于原核生物对真核生物的prepro序列不能识别。随后，Born等将目光转向酵母，然而天然蛋白质在酵母细胞中表达很不稳定，另外一个问题是酵母细胞不易破碎。因此，preproPTH基因在酵母中表达产量较大肠杆菌体系没有明显的提高。Rabbani等(1988)将人工合成的PTH基因在大肠杆菌中表达，产物不均一，包括了PTH(8-84)，PTH(3-84)，fMet-PTH和完整PTH。为了提高目标产物的稳定性，人们想到用融合蛋白形式。Hogset等(1990)采用金黄色葡萄球菌蛋白A的启动子和信号肚序列在大肠杆菌中表达PTH，产物分泌到培养基中，分离纯化方法简单迅速。酵母б因子表达系统也是比较理想的融合蛋白表达体系，即用外源基因代替α因子的编码序列，外源蛋白会与α因子引导肽形成融合蛋白。在一系列与膜相关的蛋白运输和分泌过程中，融合蛋白在KEX2基因产物类胰蛋白酶和STE13基因产物二肽氨肽酶作用下生成具有正确高级结构的外源蛋白。这些外源蛋白或直接分泌到培养基中或在细胞周质空间积累。采用α因子表达系统在啤酒酵母中表达PTH，也出现产物不均一现象，除了完整PTH，还有两个不同的糖基化形式。