[发明专利]重组人甲状旁腺素(1～34肽)的串联表达方法

权利要求书

1.一种编码重组人甲状旁腺素(1～34肽)的DNA序列，其特征在于，其编码如SEQID NO：2所示的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1所示的DNA序列有95％的同源性。

2.一种含有编码串联蛋白基因的表达载体的制备方法，其特征在于，它包括步骤：

a.在每个单体基因前5’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BglII酶切位点，在其3’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BamHI酶切位点。

b.通过PCR扩增得到目的人甲状旁腺素(1～34肽)基因，PCR产物经BglII、BamHI双酶切后，回收目的片断；

c.在合适的条件下，通过BglII+BamHI位点连接入表达载体，获得载体/PTH1，BglII+BamHI双酶切载体/PTH1，获得PTH1-BglII-BamHI，将PTH1-BglII-BamHI连接入经过BamHI和碱性磷酸酶处理后获得的载体/PTH1载体片段，获得载体/PTH2，再以同样的方法获得载体/PTH2，如此循环，可以获得含有编码串联蛋白基因的表达载体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的单体基因是核苷酸序列。较佳地，所述的单体基因是如权利要求1所述的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列。较佳地，所述的表达载体是pThioHisA/PTH-fusion。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的表达载体或权利要求2所述的编码串联重组人甲状旁腺素(1～34肽)的DNA序列。

6.一种生产重组人甲状旁腺素(1～34肽)的方法，其特征在于，它包括步骤：

a)在适合的表达条件下，培养如权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出重组人甲状旁腺素(1～34肽)串联蛋白；

b)分离纯化出表达的人甲状旁腺素(1～34肽)蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的宿主细胞是大肠杆菌。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中进行高密度悬浮培养。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括步骤：

i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体；

ii)对发酵沉淀进行压榨破菌、收集压榨上清；

iii)层析纯化，所述的层析选自：阴离子交换层析、金属螯和亲和层析、阳离子交换层析及其组合。

iv)采用肠激酶EK酶切后，经进一步纯化及羧肽酶B和Kex2酶切后获得目的蛋白。对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体；