[发明专利]一种降低蛋黄胆固醇含量的微生物饲料添加剂的制备方法

权利要求书

1.一种降低蛋黄胆固醇含量的微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：生产菌种通过微波诱导和射线诱导相结合，生产工艺采用复合培养及驯化相结合的发酵技术，培养基中添加产物促进剂，其生产步骤为：

第一步：发酵菌株选育

a.菌株传代：采用农业部菌种保存中提供的枯草芽孢杆菌菌株通过营养琼脂培养基传代培养，双歧杆菌、植物乳杆菌、乳酸链球菌通过乳酸菌培养基传代培养，选育生长速度快、菌落特征明显的菌种，在4℃温度下保存菌种；

b.菌种的复合诱导：将保存的枯草芽孢杆菌用0.9％的生理盐水稀释至10^-8-10^-9，在微波炉中用低火处理菌悬液40秒-55秒，利用血球计数法计数，将处理后的菌悬液在淀粉培养基的平板上涂布，在30-40℃温度下倒置培养48小时，选育出培养基中透明圈直径与菌落直径的比值大于0.8的菌落，接种至营养琼脂试管中保存；

将双歧杆菌、植物乳杆菌、乳酸链球菌分别制作菌悬液，将枯草芽孢杆菌制作孢子悬浮液，稀释至10^-5-10^-7，在30cm处用功率为15-20W的紫外灯，波长为260nm，处理15-30秒，处理后的菌悬液在乳酸菌培养基平板中在30 -40℃温度下倒置培养48小时，选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验，筛选双歧杆菌、植物乳杆菌、乳酸链球菌和枯草芽孢杆菌；

c、生产菌种的制作：将筛选出的双歧杆菌、植物乳杆菌、乳酸链球菌和枯草芽孢杆菌、转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在35-40℃温度下培养45-50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2-6℃的冰箱中进行保存；

第二步：乳酸菌的液体单独培养：

a.按以下重量百分比称取茄子瓶中各生产菌种：双歧杆菌38-45、植物乳杆菌25-33、乳酸链球菌8-12、枯草芽孢杆菌10-29；

b.将称取的双歧杆菌、植物乳杆菌和乳链球菌混合，将混合后的菌种按1∶17-25的比例添加在由糖蜜3.5-10％、蛋白胨0.5-1％、葡萄糖1-3、氯化钠0-1％、酵母膏3.5-6％、硫酸镁0-1％、水78-91.0％组成的液体培养基中，调节ph值至6-8，放入容器中加温至110-130℃进行灭菌20-40分钟，冷却至25-35℃后在发酵罐中搅拌30分钟，放入密闭的消毒桶内厌氧发酵8-10天，发酵过程中每天测定Ph值并释放产生的气体，防治发酵桶爆裂，待Ph值到达3.5-4.0时结束；

第三步：菌群的驯化和扩大培养：

a.将步骤2中的液体与称取的枯草芽孢杆菌菌种混合，按1∶25-30的比例接入在120-130℃温度下、高温灭菌30-45min的由豆粕4-7％、大豆粉20-23％、青糠40-45％、糖蜜8-12％、磷酸氢二钾0-0.5％、磷酸二氢钠0-0.5％、硫酸镁0-1％、无菌水12-28％组成的固体扩大培养基中，在培养基中添加0.05％-0.1％的苯乙醇作产物促进剂，搅拌30-45min至均匀，倒入饲料袋中密封发酵，温度为30-35℃，时间8-10天；

b、发酵过程中取样三次，测定水分和Ph值，发酵结束后取样，测定水分为35-40％、Ph值为4.5-6.0；

第四步：粉碎过筛

a.将发酵好的产品在42℃下干燥15小时，干燥后产品进行粉碎，粉碎后的产品过50目筛，筛出的粗料再进行粉碎和过筛；

b.过筛后装入包装袋中，转入成品库有序堆放，通知品管部门取样检测，主要参数：水份≤12.0％、活菌数≥30亿/g、总蛋白量≥28％；物理性状：淡黄色粉末状固体。