[发明专利]聚乙二醇修饰的神经毒素,其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地说，涉及一种聚乙二醇修饰的神经毒素、其制备方法及用途。

背景技术

神经毒素(neurotoxin，NT)是一类单链多肽，可以从金环蛇(Bungarusfasciatus(Schneider))，银环蛇(Bungarus multicinctus multicinctus(Blyth))，眼镜蛇(Naja naja(Linnaeus))及眼镜王蛇(Ophiophagushannah(Cantor))的毒液中分离提纯得到。按照作用靶部位的不同，神经毒素可以分为突触前神经毒素和突触后神经毒素。由于突触前神经毒素的致死活性比突触后神经毒素高得多，所以临床上应用较多的是突触后神经毒素。

目前实测的突触后神经毒素全序列有100多个。它们的分子量大约为6800，多为碱性蛋白，等电点在9～10之间，不具有酶活性，功能单一，只作用于乙酰胆碱受体。其中的短链神经毒素含60-62个氨基酸残基及4个二硫键，长链神经毒素含65-74个氨基酸残基及5个二硫键。序列比较表明，短链神经毒素之间的同源性高达70～95％以上，它们都有明显的氨基酸残基重复的现象，例如QQ，TT，GG等。来源于眼镜蛇毒的短链神经毒素N端序列大都为LECHNNQQ。短链神经毒素是乙酰胆碱的强拮抗剂，它竞争性地结合位于神经-肌肉接头后膜的乙酰胆碱受体(AChRs)，阻止肌肉细胞的去极化，使动物产生松弛性肌肉麻痹，最后因呼吸衰竭而死亡。

中国专利CN104096A和CN1209998A公开了一种来源于眼镜蛇蛇毒神经毒素的制备方法及临床戒毒和止痛的医学用途。长期的临床使用表明，神经毒素对停用或禁戒海洛因、吗啡等后出现的各种生理和精神依赖症状均有一定疗效，且具有无成瘾性、无耐受性的特点。

但是对于人体而言，神经毒素属于异源蛋白，所以在使用过程中同样具有蛋白质药物所共有的特点，如存在免疫原性，半衰期短，稳定性差等。其中由眼镜蛇神经毒素引起的过敏反应已有报道。(刘文，陈慧，郑惠.科洛曲片致过敏性休克.药物不良反应杂志[J].2001，(3)：196.)为此，有必要采用蛋白质修饰技术以获得低免疫原性的眼镜蛇神经毒素，从而改善该蛋白质的药物动力学特性，以提高其耐受性和减少给药次数。

目前普遍采用的改造蛋白质分子的方法是大分子化学修饰法。所谓蛋白质的大分子化学修饰，是相对于采用较小分子量的修饰剂去修饰蛋白质而言的。大分子修饰剂，通常指一些人工或天然的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，右旋糖苷(葡聚糖)，人血清白蛋白，肝素，聚赖氨酸，聚丙氨酸，聚乙烯酸和聚乙烯砒咯烷酮等(Lundblad，R.L.Bradshaw，R.A.Applications of Site-Specific Chemical Modification in the Manufacture ofBiopharmaceuticals：I.An Overview.Biotechnol.Appl.Biochem.1997，26：143-151.)。其中应用最多、成功率最高的是PEG修饰技术。

用于修饰蛋白质药物的PEG有很多种，包括修饰氨基的烷基化PEG和酰基化PEG，修饰巯基的PEG马来酰亚胺和PEG-邻-吡啶二硫醚等，以及修饰羧基的PEG-酰肼等。典型的修饰反应列举如下：

A：PEG-醛；B：PEG-羟基琥珀酰亚胺酯；C：PEG-马来酰亚胺；D：

                     PEG-酰肼

修饰研究中大多数是将多肽分子中的氨基作为修饰位点。

为克服蛇毒神经毒素作为药物使用所存在的不足，采用聚乙二醇修饰技术对神经毒素的氨基进行修饰，以获得聚乙二醇修饰的神经毒素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的神经毒素存在免疫原性，半衰期短，稳定性差等缺陷，采用蛋白质修饰技术以获得低免疫原性的眼镜蛇神经毒素，从而改善该蛋白质的药物动力学特性，以提高其耐受性和减少给药次数，更好地满足神经毒素在临床应用方面的需求。

本发明的一个目的是提供一种聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，神经毒素的氨基上连接有活化的聚乙二醇或其衍生物链。

优选地，所述聚乙二醇修饰的神经毒素具有如下通式结构：

其中：m为单甲氧基(monomethoxy)的缩写，n＝2～5；

R代表去除一个氨基(NH₂)的神经毒素分子。