[发明专利]播娘蒿抗寒基因DsCOR及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种播娘蒿抗寒基因DsCOR及其制备方法，还涉及包含该播娘蒿抗寒基因DsCOR的重组质粒的应用，属于生物工程技术领域。

技术背景

温度是植物正常生长、生存的重要条件之一，同时也是限制植物形态和分布的因素之一。植物都有适合自身生长和生存的温度范围，环境温度超过这个范围值就会影响植物的正常的生长和发育，从而引起植物自身的损伤，甚至导致植物死亡。

低温伤害植物是全球性的，全世界每年因低温而造成的经济损失十分巨大，是世界农业生产中一项非常严重的自然灾害。日本仅1980年遭受寒害的面积达289.6公顷，占耕地面积的50％还多，总损失达到6000亿日元。

我国幅员辽阔，纬度跨度大，气候多样，寒害时有发生，尤其是东北三省和沿海地区。寒害现在已成为我国重要的自然灾害之一，并且有逐渐加剧的趋势，有可能成为农业生产上最大的自然灾害。建国以来，东北地区就发生过多次较为严重的寒害，主要是由于早春气温不均衡，昼夜温差大，夜间低温偏低，严重阻碍了植物的生长和发育。另外，在没有防备的情况下偶遇寒流，倒春寒造成的损失也极其严重，使粮食减产约7-10％。寒害在使作物减产的同时还降低其品质。所以，对抗寒机理和相关调节基因的研究势在必行。

目前，解决寒害的基本途径有三条：一、采取更为先进的栽培措施，如发展保护地设施来提高低温和气温，满足作物生长的需要，避免低温危害；二、对已经有的植物品种，尤其是具有较高经济价值的植物品种进行改良，然而传统的植物改良方法费时、费力、并缺乏针对性；三、随着植物抗寒机制的研究，抗寒相关基因的克隆以及转基因技术的发展，以烟草、拟南芥和番茄为受体植株的转基因植物的研究，使利用基因工程培育高效抗寒品种成为一条重要途径，因此，迫切需要开发抗寒的相关的基因与蛋白。

播娘蒿(Descurania sophia(L.))同拟南芥一样，同属十字花科。但其具有适应性极强，分布广泛的特点。它在川西高原海拔4000米的地区也生长良好，在西北干旱、盐碱地区，播娘蒿也成为优势类群。经多方面调查研究结果均表明，播娘蒿具有极强的适应恶劣环境的能力。播娘蒿的药用、营养保健、工业产油方面都得到了较多的研究，但是对其抗寒基因的研究目前还是空白。与其他的十字花科植物相比，播娘蒿具有极强的耐寒特性，因此本发明将以播娘蒿作为抗寒机理研究的主要材料。

发明内容

本发明的目的正是针对现有技术所存在的缺陷，提供一种播娘蒿抗寒基因DsCOR及其制备方法。

本发明的另一目的还提供一种含有播娘蒿抗寒基因DsCOR的重组质粒及其制备方法。

本发明的另一目的还进一步提供一种播娘蒿抗寒蛋白DsCOR及其制备方法。

本发明的又一目的还公开一种包含播娘蒿抗寒基因DsCOR的重组质粒在植物抗寒性与耐寒性中的应用。

本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。

本发明所述的播娘蒿抗寒基因DsCOR含有序列表SEQ ID NO：1中所述的核苷酸序列。

本发明所述的含有播娘蒿抗寒基因DsCOR的重组质粒，它含有上述所述的核苷酸序列。

本发明所述的播娘蒿抗寒蛋白DsCOR，含有序列表SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列。

上述的技术方案中，所述的播娘蒿抗寒蛋白DsCOR是由139个氨基酸构成的蛋白质。

本发明所述的播娘蒿抗寒基因DsCOR的制备方法，包括以下步骤：

(1)材料的培养，将播娘蒿种子经过消毒处理后，播种于含有MS0培养基的培养罐内；

(2)提取冷驯化后的播娘蒿总RNA，经1％非变性琼脂糖凝胶电泳，用260～280nm波长的紫外光扫描来分析其质量；

(3)采用RACE方法克隆得到播娘蒿抗寒基因DsCOR的全长序列，RACE采用的简并引物为COR01：5’-ATGGC(T/G)ATGTC(A/T)(C/T)T(C/A)TCAGGA-3’，COR02：5’-TA(C/T)GTN(A/G)(A/C)GG(C/A)N(A/G)(A/G)AGG-3’。

本发明所述的含有播娘蒿抗寒基因DsCOR的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)根据上述得到的播娘蒿抗寒基因DsCOR的全长序列，设计一对能扩增出完整开放阅读框(ORF)的引物，在正向引物和反向引物上分别引入限制性酶切位点；