[发明专利]播娘蒿抗寒基因DsCOR及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种播娘蒿抗寒蛋白DsCOR的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种包含播娘蒿抗寒基因DsCOR的重组质粒，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种播娘蒿抗寒蛋白DsCOR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.按照权利要求3所述播娘蒿抗寒蛋白DsCOR，其特征在于，所述的DsCOR由139个氨基酸构成的蛋白质。

5.权利要求1所述的播娘蒿抗寒基因DsCOR的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)材料的培养，将播娘蒿种子经过消毒处理后，播种于含MS₀培养基的培养罐内；

(2)提取冷驯化后的播娘蒿总RNA，经1％非变性琼脂糖凝胶电泳，用260～280nm波长的紫外光扫描来分析其质量；

(3)采用RACE方法克隆得到播娘蒿抗寒基因DsCOR的全长序列，RACE采用的简并引物为COR01：5’-ATGGC(T/G)ATGTC(A/T)(C/T)T(C/A)TCAGGA-3’，COR02：5’-TA(C/T)GTN(A/G)(A/C)GG(C/A)N(A/G)(A/G)AGG-3’。

6.权利要求2所述的包含播娘蒿抗寒基因DsCOR的重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据已知的播娘蒿抗寒基因DsCOR的核苷酸序列，设计一对能扩增出完整开放阅读框(ORF)的引物，在正向引物和反向引物上分别引入限制性酶切位点；

(2)将上述扩增得到的播娘蒿抗寒基因DsCOR的ORF克隆到中间载体pMD18-T，进一步克隆到植物表达载体pBI121或p2301G；

(3)将上述的表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，用于转化模式植物的COR15a缺失突变株。

7.权利要求3所述的播娘蒿抗寒蛋白DsCOR的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建原核表达载体pET32a-DsCOR，并转化大肠杆菌BL21；

(2)播娘蒿抗寒蛋白DsCOR的诱导表达及SDS-PAGE检测；

(3)播娘蒿抗寒蛋白DsCOR的纯化：先超声波破碎，再煮沸，然后过Ni亲和层析柱，最后PEG浓缩。

8.权利要求2所述的包含播娘蒿抗寒基因DsCOR的重组质粒，其特征在于，在植物抗寒性与耐寒性中的应用。