[发明专利]基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物和检测技术

说明书

技术领域

本发明属于磁共振成像造影剂领域，涉及基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物。本发明还涉及上述耦联物中抗体是否具有活性的检测技术。

背景技术

磁共振成像(MRI)技术现已发展成为临床医疗诊断中的一种常见手段，是诊断肿瘤最为有效的方法之一。为了增强病变组织与正常组织图像之间的对比度和清晰度，需要选择合适的造影增强剂来显示解剖学特征。这些造影增强剂绝大多数是利用金属离子的顺磁特性。Gd³⁺因为具有强顺磁性，它的络合物是目前应用最广泛和最有效的一类造影增强剂。最近的研究结果表明，Gd@C₈₂(OH)₄₀的MRI造影效率是临床所用Gd-DTPA【二乙烯三胺五醋酸，DTPA】螯合物造影剂的20倍(Mikawa，M.，et al.，Bioconjugate Chemistry，2001.12(4)：p.510-514)。此发现表明基于金属富勒烯的水溶性衍生物可用于制作高效的MRI造影剂。但基于金属富勒烯的具有靶向性检测功能的MRI造影剂的研究尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物，其制备过程简单，反应条件温和，有扩大成工业生产的巨大的应用前景。利用本发明技术制备的耦联物可以使抗体富集并保持其活性，可成为靶向性MRI诊断材料。

本发明的另一目的在于提供上述耦联物中抗体是否具有活性的检测技术，用全反射荧光显微镜进行单分子水平荧光强度检测，通过与对照(符合一步漂白曲线的单分子抗体与单分子绿色荧光蛋白作用)比拟，推测出一个聚集体单元的平均耦联数和活性。

本发明的基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物，是将含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物用1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化后直接与抗体发生耦联反应制得，具体可按如下步骤制备：

(a)将含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物用新鲜制备的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液活化，优选10～20分钟；所述的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐和含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物的摩尔比优选为50～100∶1；

(b)将相对于含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物1/10～1/20摩尔当量的抗体加到步骤(a)得到的溶液中搅拌反应，优选3～4小时，即可得到本发明的基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物(MRI-anti)。所述的抗体为绿色荧光蛋白抗体或肿瘤抗体，所述反应优选在室温下进行(如15～25℃)。

所述的步骤(a)中的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐水溶液应新鲜制备，即现配制现使用，否则会水解而失效。

所述的含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物，是把含Gd的金属富勒烯笼外修饰羧基后制得，其分子表达式为：

Gd@C₈₂O_m(OH)_n(NHCH₂CH₂COOH)_l，式中m＝2～6，n＝12～18，l＝6～8；或

Gd@C₆₀[C(COOH)₂]₁₀。

所述的含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物可分别按如下参考文献制备：

Gd@C₈₂O_m(OH)_n(NHCH₂CH₂COOH)_l制备文献见Shu，C.Y.，et al.，Carbon，2006.44(3)：p.496-500。

Gd@C₆₀[C(COOH)₂]₁₀制备文献见Bolskar，R.D.，et al.，Journal of theAmerican Chemical Society，2003.125(18)：p.5471-5478。

具体：

上述的含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物Gd@C₈₂O_m(OH)_n(NHCH₂CH₂COOH)_l，可按如下步骤制备：

(a)配制浓度为0.5～3mol/L的β-丙氨酸的碱溶液(如NaOH或KOH溶液等)，并加入该碱溶液体积2～4倍量的乙醇；