[发明专利]用于测定具有生物来源和复杂组成的样品中一种或多种分析物的方法及其用途

说明书

本发明涉及用于检测一个或多个生物来源和复杂组成的样品中一种或多种分 析物的方法。

发明背景

许多应用领域都需要通过外部作用，例如通过提供生物活性化合物的方式来确 定复杂样品中的多种生物相关分析物，例如在用于确定个体健康状况或治疗效果 的诊断过程中，或者在用于确定生物系统影响，如有机体及其复杂的作用模式的 药物研究开发过程中。

尽管已知的分析分离方法通常进行了优化以根据预定义的理化参数，例如分子 量或分子的荷质比来在尽可能短的时间内分离存在于给定样品中的尽可能大量化 合物，但生物亲和性检测方法是基于在各种情况下利用一种尽可能高特异性的生 物或生化或合成的识别部件，以便以高度选择性的方式来识别和结合复杂组成样 品中相应的(单个)分析物。因而检测大量不同化合物需要采用相应数量的不同 特异性识别部件。

基于生物亲和性反应的任何检测方法既可以在均匀溶液中进行也可以在固体 载体的表面进行。根据所述方法的特殊设计，其需要在分析物与相应的识别部件 结合之后并且任选地在进一步与检测物质结合后，并同样任选地，在各方法步骤 之间的各种情况下进行洗涤步骤，以分离产生的所述识别部件与待测分析物的复 合物，同样任选地从剩余样品中分离其它检测物质以及任选采用的附加试剂。

现在较为广泛使用的是，利用固定于固体载体上的不连续的、空间分隔的测量 区域中作为识别部件的相应互补核酸来同时检测样品中大量不同核酸的方法。例 如，已经公开了基于简单玻璃载玻片或显微镜载玻片的并具有非常高特征密度(共 同固体载体上的测量区域的密度)的作为识别部件的寡核苷酸阵列。例如，美国 专利No.5445934(Affymax Technologies)描述并要求保护一种密度大于每平方厘 米1000个特征的寡核苷酸阵列。

近年来，更常见的记载是用于同时测定大量蛋白质的阵列以及利用其实施的类 似种类的检测方法，例如美国专利No.6365418B1，特别是利用固定抗体作为待测 分析物的识别部件的阵列。

涉及检测核酸和其它生物高分子如蛋白质的这种“微阵列”的专利文件中记载 了在各种情况下，将多种不同的特异性识别部件固定在不连续的测量区域中以形 成用于分析物识别的阵列，然后将含有分析物(任选地在复杂的混合物中)的待 研究样品与该“捕获阵列”相接触。根据所公开的说明书，这里不同的特异性识别部 件在各种情况下都以最高可能性的纯度存在于不同的不连续测量区域中，这样通 常样品中的不同分析物就结合到具有不同识别部件的测量区域。

已知的阵列类型需要通过有时非常复杂的加工步骤来以尽可能高纯的形式纯 化和浓缩所述待固定的特异性识别部件。由于不同的识别部件多多少少在理化性 质上有所不同(例如其极性)，故用于在共同的固定载体上的不连续测量区域中， 任选地在施加于其中的促粘附层上，用于优化固定所述识别部件的条件也有相应 的不同，例如通过吸附或共价结合的方式。因此，选择固定多种不同识别部件的 固定条件(例如，促粘附层的种类)很难同时针对所有的识别部件优化，而仅在 不同的识别部件的固定特性之间进行折中。另一个缺点是在各种情况下每个阵列 仅有一个施加的样品可以用于在这种捕获阵列中存在的分析物的研究。

因而需要一种改良的阵列设计，其能够针对存在于所述样品中的分析物进行大 量样品的分析，可以在一个阵列上或者在共同载体上的多个阵列上同时进行，或 者在多个载体上的多个阵列上顺序进行。为此，可以很方便地将被研究的样品本 身而不是不同的特异性识别部件施加到一个或多个载体上的一个或多个阵列的不 连续测量区域中，这是以直接的方式，即未处理的形式，或者在尽可能少的一些 制备步骤之后进行的。这种阵列设计在下文中将称为“反式测试架构”。

为了满足这种需要，例如，最近Paweletz等人在Oncogene 2001，Vol.20，1981- 1989中基于反式测试架构提出了这种用于蛋白质检测的阵列，命名为“反相蛋白质 微阵列”。

这种分析物检测方法，利用微阵列以及甚至更通用的在表面上进行的检测方 法，其基于结合试剂作为待测分析物的特异性结合配对物的特异性结合，的一个 常见的问题是非特异性结合事件的发生，其并非基于分析物和用于检测分析物的 结合试剂之间、以及任选的进一步的检测试剂之间的特异性相互作用。