[发明专利]稳定的蛋白酶组合物

说明书

发明领域

本发明涉及一种酶组合物，其中通过在本发明的组合物中的一些添加物稳定该酶。更具体地，本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶组合物，包含丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂和如下定义的附加的稳定剂M。

背景技术

丝氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，其特征在于在它们的活性位点上具有丝氨酸和组氨酸残基。很多众所周知的酶都属于此类，例如胰蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶和纤溶酶。已经发现它们中的一些的实际应用。胰蛋白酶用于皮革工业。凝血酶用作止血剂以阻止伤口出血。另外两种丝氨酸蛋白酶-尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂在临床上用作血栓溶解剂，用于治疗急性心肌梗塞。很多这样的酶已经广泛地用作研究工具，例如在蛋白质结构确定中。此外，这些酶可以在很多诊断试剂盒中使用。

对于大多数的丝氨酸蛋白酶，它们在溶液中的稳定非常有限，这主要是由于当保留在溶液中时它们由于蛋白酶的性质会发生自降解。当必须要把材料贮存在溶液中时，有限的稳定就是一个问题。现在可用的商业丝氨酸蛋白酶制剂主要都是冷冻溶液或冻干粉末，它们具有显而易见的缺点。溶解粉末或将冷冻溶液融化至适当的温度所需的额外时间是最重要的问题。但是，这些制剂还有其他的问题。对于冷冻溶液，在制造和运输到贮存的所有步骤中都需要控制温度(-20℃)。对于冻干粉末，需要重新生成的溶液具有可接受级别的纯度和稳定。同时，该材料通常需要在非可控(例如严酷天气或缺少清洁水供应)的环境中无菌制备(通过将这两部分混合)，需要检验粉末是否已经适当混合。这些都是当前可用的产品的主要缺点，另外它们使用复杂并且成本较高。

对于优选在阻止出血中必须立即使用的凝血酶，稳定问题迫使生产商必须使用冻干的凝血酶或深度冷冻的溶液。然后，需要一定的时间制备才能进行使用。两种血栓溶解剂-尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂都是以冻干制剂的形式出售，它们必须在使用前溶解。由于必须在梗塞开始后尽可能早地开始急性心肌梗塞的血栓溶解治疗，这些制剂产生的任何时间延迟都会成为问题。

已经做出很多的努力来发现稳定各种丝氨酸蛋白酶的方法。对于会相当快地自降解的胰蛋白酶，一种简单和有效的稳定剂是钙离子(Sipos T和Merkel J，Biochemistry 9：2766(1970))。将pH降低到4以下也是处理一些酶例如胰蛋白酶和纤溶酶的方法，但不适用于凝血酶，这是因为它在pH小于5时会不可逆地失活。可以使用可逆的蛋白酶抑制剂，但是并不通行，因为当使用它们本身时，它们会以有害的方式干扰酶的作用(见下文)。

为了稳定组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，一般使用的方法是加入氨基酸-精氨酸。现在临床使用的tPA材料包含精氨酸作为稳定剂。

同时，做了很多努力来发现稳定凝血酶溶液的方法。作为稳定添加物的例子，建议了下列的材料：高浓度的羧酸、EDTA、各种氨基酸、白蛋白、聚合物例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇、甘油、各种无机盐、糖类、明胶、胶原。

日本专利申请JP2004191367描述了包含试验试剂的稳定的凝血酶，用于试验血凝结能力。该试验试剂包含凝血酶和凝血酶抑制剂，也可以包含一种或多种稳定凝血酶的化合物，选自钙离子、有机酸、表面活性剂和蛋白质。

WO 02/100830、WO 02/22575、WO 00/20394、WO 99/11658、WO02/37937和US 5,409,927都描述了不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂化合物及它们在制备治疗各种疾病情况，例如血栓形成中的应用，其中指出了抑制相应的丝氨酸蛋白酶。

Nakamura等人(J.Chrom.A，1009，(2003)，133-139)描述了固定的蛋白酶抑制剂在胰蛋白酶-样蛋白酶的亲和色谱中的应用。

Turner等人(Biochemistry，25，(1986)，4929-4935)描述了三种对-脒基苯基酯，它们不可逆地抑制人的因子IXa。

Tsung Fu Yang等人(Biomacromolecules，25，(2004)，1926-1932)描述了阳离子型聚合物N，N-二乙基乙二胺聚氨酯的合成，该聚合物可以用于基因递送。

US专利申请2001/0033837(对应于EP 1 136 084 A1)描述了一种凝血酶制剂，包含非共价结合的抑制剂作为稳定剂。此外，该抑制剂与其他稳定添加物例如糖或羧酸组合，以前在专利和其他出版物中已经描述了这些稳定添加物。

JP 2000300250描述了凝血酶溶液的稳定，包括在不同的缓冲溶液中加入聚乙烯醇、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。