[发明专利]含有缺损的鞭毛蛋白基因的革兰氏阳性菌细胞、基于鞭毛蛋白的融合蛋白以及从液体中除去金属离子的用途

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白，更具体而言，涉及由革兰氏阳性菌制备的重组蛋白。

背景技术

细菌重组蛋白的制备通常在革兰氏阴性菌特别是在大肠杆菌中进行。需要开发在革兰氏阳性菌中制备重组蛋白和肽的方法。

发明内容

本发明者开发了保藏号为NCIMB41348的革兰氏阳性嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)Alk36细菌菌株，将其转化，使得在其表面生产和表达由鞭毛蛋白和位于鞭毛蛋白氨基酸序列内的多种任意异源多肽组成的融合蛋白。这些重组细菌在重组细菌细胞的表面产生高水平的稳定和可溶性的重组蛋白。本发明者还开发了含有编码鞭毛蛋白的核苷酸序列以及位于编码鞭毛蛋白的核苷酸序列内的位点的基因结构，在这些位点内可以将编码异源多肽的核苷酸序列插入。本发明的特征在于修饰的细菌系，所述细菌系适于制备本发明的基于鞭毛蛋白的融合蛋白(FBFP)、对制备融合蛋白有用的结构、FBFP、编码FBFP的核酸、含有所述核酸的载体、含有所述载体的细胞、表达FBFP的转化细菌系以及制备和使用所述FBFP的方法。

更具体而言，本发明的特征在于细菌细胞的基本纯的培养物，其中大多数的细菌细胞含有缺损的鞭毛蛋白基因，所述缺损阻止功能鞭毛蛋白的表达。本发明还包括一种分离的、含有缺损的鞭毛蛋白基因的细菌细胞，所述缺损阻止功能鞭毛蛋白的表达。在上述两种情况下，所述缺损可以是通过使用不编码多肽或者非功能鞭毛蛋白多肽的DNA序列替代所述大多数的细菌细胞中的内源基因。所述细菌细胞可以是革兰氏阳性菌细胞，例如芽孢杆菌细胞，如嗜碱芽孢杆菌细胞。所述细胞可以是BhFC01(Δhag)菌株。所述非功能鞭毛蛋白多肽可以缺失SEQ ID NO：2的14-226位氨基酸。

除了含有缺损的鞭毛蛋白基因外，大多数的细菌细胞或者分离的细菌细胞可以缺损至少一个细胞壁蛋白酶基因，并且所述缺损可以是使用不编码多肽或者非功能细胞壁蛋白酶的DNA序列替代所述大多数的细菌细胞中的内源基因。所述细菌细胞可以是如上所列的那些细胞。所述的至少一个细胞壁蛋白酶基因可以是wrpA基因，所述缺损可以包括缺失细胞壁蛋白酶基因的整个编码序列。所述细胞可以是2005年11月23日在NCIMB以保藏号_______保藏的BhFC04(hag，wprA)细胞。

本发明的另一方面是一种芽孢杆菌属细菌的基因工程方法。所述方法包括在所述细菌的染色体中缺损hag基因，所述缺损阻止所述基因对功能鞭毛蛋白的表达。所述芽孢杆菌细菌可以是嗜碱芽孢杆菌细菌。

所述方法还可以包括缺损编码一个或者多个细胞壁蛋白酶的一个或多个基因，所述缺损阻止所述的一个或多个基因对所述的一个或者多个功能细胞壁蛋白酶的表达。所述一个或者多个细胞壁蛋白酶基因可以包括wrpA基因。

本发明还包括一种融合蛋白，其含有：全部或者部分细菌鞭毛蛋白，所述部分细菌鞭毛蛋白包含所述鞭毛蛋白的N-端和C-端保守区；异源多肽，位于所述鞭毛蛋白的可变区内或者代替所述鞭毛蛋白的可变区。如果由细菌细胞制备融合蛋白，那么所述融合蛋白具有能在所述细菌细胞表面上表达的能力。所述异源多肽可以具有能结合金属离子能力的多肽。所述金属离子可以是镍、铜、镉、铂、钯、钛、银或金，所述异源多肽可以是聚组氨酸序列。所述聚组氨酸序列可含有六个组氨酸残基。

此外，所述异源多肽可以是酶或者酶的功能片段。所述酶可以是脂肪酶，例如喜热噬油芽孢杆菌(G.thermoleovorans)脂肪酶A。所述酶可以是水解酶，例如淀粉酶、蛋白酶、酯酶或者纤维素酶。此外，所述异源多肽可以是免疫原。

所述融合蛋白还可以包括所述异源多肽N-端的1-15个接头残基N-端和/或所述异源多肽C-端的1-15个接头残基C-端。其还可以包括所述异源多肽N-端的N-端切割位点和所述异源多肽C-端的C-端切割位点。

本发明还提供了一种编码上述融合蛋白的核酸；包含所述核酸序列的载体，例如，所述核酸序列可操作性地与转录调控元件(TRE)连接的载体；以及含有所述载体的分离的细胞。所述细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。所述细菌细胞可以是革兰氏阳性菌细胞，例如芽孢杆菌属细胞，如嗜碱芽孢杆菌种细胞。所述细胞可以是2005年11月23日在NCIMB以保藏号_______保藏的BhFC04(hag，wprA)菌株。

本发明的另一方面包括一种制备融合蛋白的方法。所述方法可以包括培养含有载体的细胞以及从培养物中得到所述融合蛋白，其中所述载体含有编码上述融合蛋白的核酸，所述核酸可操作性地与TRE连接。