[发明专利]树脂上肽环化

说明书

本发明涉及在固相肽合成(SPPS)中形成二硫键的方法。

可采用多种保护基来保护半胱氨酸残基，例如三苯甲基、乙酰氨基甲基-、 叔丁基、三甲基乙酰氨基甲基、2，4，6-三甲氧基苄基、甲氧基三苯甲基、叔丁基 硫基(t-butylsulfenyl)。

在肽合成过程中最常见的是使用三苯甲基进行标准半胱氨酸侧链保护。在 对随后环化成胱氨酸的半胱氨酸的保护中，最广泛使用的是伴随碘氧化作用的 乙酰氨基甲基(acm)-保护基(Kamber等，1980，Helv.Chim.Acta 63，899-915； Rietman等，1994，Int.J.Peptide Protein Res.44，199-206)。

已描述了除碘以外的多种氧化剂，它们使得胱氨酸得以在液相肽环化作用 中形成(例子来源于Albericio等，在Chan和White编辑的“FMOC Solid-phase Peptide Synthesis”《FMOC固相肽合成》，Oxford university Press 2000，第91-114 页：水性缓冲液中的谷胱甘肽、DMSO、铁氰化钾、Ellman试剂5，5’-二硫代双-(2- 硝基苯甲酸)、碘、三氟乙酸铊(III)、烷基三氯甲硅烷-亚砜、三氟甲烷磺酸银 -DMSO(在强酸性中介导氧化作用)。

通常，所有的这些方法都会产生不希望的多种副产物，且需要将反应时间 延长到10-20小时来获得最佳产率。

Volkmer-Engert等(J.Peptide Res.51，1998，365-369)描述了使用溶于水性 溶剂中的氧进行的炭催化的二硫键的氧化形成。仔细控制证明了自然溶解于水 性介质的一定量的氧气是必需的，且足以用氧负载炭来进行氧化反应。与传统 没有催化剂存在的空气鼓泡法(air-sparging)相比，使用炭显著加速了反应速度。

使用炭就不可避免地需要在均相溶液中而不是在树脂上进行该反应；后继 的脱保护反应步骤不能耐受炭的继续存在，虽然不可能从肽-树脂固相上去除 炭。

WO 03/093302描述了从固相上释放后的含色氨酸的肽在溶液中的环化。该 肽带有C-末端半胱氨酰-羧酰胺(carboxamide)，其侧链巯基官能团未被保护，且 还用3-巯基-丙酰胺或3，3’-二硫代-(1-羧基-丙基)丙酰胺部分对所述肽的N-末端 进行衍生。通过半胱氨酸侧链的硫酯键将肽以其侧链锚定在树脂上，该方法不 再需要半胱氨酸酰胺侧链的保护和/或脱保护。在从树脂上切割下之前，用二硫 代丙酸盐(酯)进行了N-末端的衍生化。由此从树脂上切割下以后，通过在半胱 氨酸和硫代丙酰胺部分之间形成二硫桥在溶液中发生环化。在环化之前从固相 上切割下和全面脱保护(除了硫代丙酰官能团以外)在本方案中是强制性进行 的。

在切割和全面脱保护期间必须极其注意保持硫代-丙酰胺部分是一个缺点。 Atherton等(1985，J.Chem.Perkin Trans.I.，2065)报道了具有双功能性的苯甲 硫醚(作为从树脂上切割的清除剂和酸解促进剂)的广泛应用同样造成了受acm、 叔丁基、叔丁基硫基保护的半胱氨酸的部分地、过早地脱保护。—整个合成路 线很复杂，该方法在许多步骤中会对产率发生不良影响。必须在高度稀释的溶 液中进行环化才能防止二聚化。在其描述中并未明确揭示获得的产率。

本发明的一个目的是提供通过固相合成更为简便和直接的合成二硫键化 环肽的其它或改进方法。根据本发明，通过包含以下步骤的肽合成方法来实现 本发明的目的：

a.合成连接于固相的肽，该肽包含至少一个半胱氨酸、高-或去甲-半 胱氨酸(nor-cysteine)残基，所述半胱氨酸在其侧链受到S-叔丁基- 硫基的保护，

b.对Nα上具有3，3’-二硫代-(1-羧基-丙基)-丙酰基-残基的另一氨基酸 进行N-末端偶联，或任选地对该N-末端氨基酸的Nα进行脱保护并 使游离Nα与3，3’-二硫代-丙酸亚胺反应，获得相应的Nα-3，3’-二硫代 -(1-羧基-丙基)-丙酰胺，或者对N-末端氨基酸的Nα进行脱保护并使 游离的Nα与式IV的化合物反应

R₇-S-S-[CH2]₂-COOH    IV

其中，R₇是芳基(芳基包括杂核芳基-)或是芳烷基-、烷基芳基-或烷 基，其可进一步被卤素、氨基(amido)、酯和/或醚取代，