[发明专利]对真性红细胞增多症中JAK2突变的鉴定

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质-酪氨酸激酶JAK2的V617F变体，该变体是造成 瓦凯红细胞增多症(Vaquez Polyglobulia)的原因。本发明还涉及首选 用于诊断与骨髓增生性疾病有关的红细胞增多和血小板增多的方法，或 者涉及对在新的疾病分类学组中重新分类的骨髓增生性疾病中JAK2 V617F变体的检测，并且涉及对特定抑制剂和siRNA的鉴定。

瓦凯红细胞增多症(真性红细胞增多症或PV)是一种与真正红细 胞增多有关的，并经常有血小板增多和白细胞增多的慢性骨髓增生性疾 病。它是造血干细胞的克隆性、获得性疾病。PV的造血祖细胞能够在缺 少促红细胞生成素(Epo)的情况下形成成红细胞集落，其被称为“自发 性集落”。PV成红细胞祖细胞对几种另外的生长因子的超敏性也已经表 明：白细胞介素-3(IL-3)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、干 细胞因子(SCF)和胰岛素样生长因子(IGF-1)。几个研究组已经对PV 的病理生理学产生了兴趣，但是直到今天对该疾病根源的分子异常仍然 是未知的(H.Pahl，2000)。

PV祖细胞对几种细胞因子的超敏性导致对涉及细胞因子受体共有 的信号转导途径的异常进行研究。在PV中从未证实有分子标记物的存 在，但是假设在PV和另外的骨髓增生性疾病(尤其是CML)之间存在 相似性，看起来可能与由Bcr-Ab1引起的那些分子机制近似的分子机制 是造成恶性克隆的显著增殖和它的终末分化的原因。该假设最近在两种 稀少的骨髓增生性疾病中被证实，即与涉及8p11染色体区易位有关的骨 髓增生性疾病，其引起FGF受体的组成性活化，和嗜伊红细胞增多症， 其中隐藏性染色体的缺失产生嵌合体基因PDGFRα-FIP1L1。在这两种 情况中，分子异常是引起具有组成性酪氨酸激酶活性的融合蛋白质的原 因。

已经发现在PV中没有再发性细胞遗传异常，即使在10～15％患者 中检测到20q缺失，和约30％的9p杂合性损失的病例(Kralvics，2002) 中也是如此。然而，这些异常并不是所述疾病所特有的。

因为PV细胞是非Epo依赖性的，所以已经进行了对Epo受体 (R-Epo)途径的研究。首先，受体在结构上和功能上都是正常的(Hess et al，1994；Le Couedic et al，1996；Means et al，1989)。当Epo刺激终止 时使R-Epo和JAK2脱磷酸的SHP-1磷酸酶正常地在RNA和蛋白质水 平上表达(Andersson et al，1997；Asimakopoulos et al，1997)。在R-Epo 信号传导的较低下游处，已经在表现出PV的患者的多核嗜中性粒细胞 (PNN)研究了STAT5的不正常活化，但是还没有发现异常。另一方面， 在14例被检查的4例PV中，已经在PNNs中证明了STAT3的组成性 磷酸化作用(Roder，2001)。最后，已经以免疫组织化学方法并通过流式 细胞仪研究了抗凋亡蛋白质bcl-xl(STAT5的转录靶)的表达(Silva et al， 1998)。已表明bcl-xl在PV成红血细胞中被超表达，在该蛋白质正常地 不再被表达的较成熟的阶段时尤其如此。

在瓦凯红细胞增多症中，当前主要的诊断标准是临床用标准(PVSG 标准：Pearson，2001)。生物学诊断基本上是基于在缺少Epo的情况下 祖红细胞的生长培养物(检测内源性集落)。由于其准确实施所需的必要 专业知识和所需的实质“技术人员耗时(technician-time)”，该检验不 是在每个中心都可以应用，并且只有在通过有经验的实验室进行实施时 才是可靠的。此外，为了获得良好的灵敏度，该检验需要来自患者的髓 细胞，这对于患者来说是令人厌烦的过程。

应用消减式杂交技术，一个德国小组已经克隆了一种在PV的PNNs 中超表达的基因，其被称为PRV1(真性红细胞增多1)(Temerinac et al， 2000)。PRV-1蛋白质属于uPAR表面受体超家族。在PV多核嗜中性粒 细胞中，编码PRV-1的mRNA的超表达能很容易地通过实时RT-PCR 被检测到；并且形成最近发现的、没有病理生理学作用的疾病标记物。 然而，最近出版的研究表明它既不是非常灵敏的也不是非常特异性的。