[发明专利]新型穿梭载体

说明书

技术领域

本发明涉及双歧杆菌属微生物与大肠杆菌的穿梭载体、在利用了该穿梭载体的双歧杆菌属微生物中能够表达所希望的基因的表达载体、经该穿梭载体转化了的双歧杆菌属微生物和以该双歧杆菌属微生物作为有效成分的抗肿瘤剂。

背景技术

长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是一种革兰氏阳性厌氧性细菌，其基因组的GC含量高(例如，参照非专利文献1)。这种长双歧杆菌为非病原性的，在人和其它动物的大肠中，构成正常的微生物群的大部分(例如，参照非专利文献2)。一般认为其具有：提高免疫反应(例如，参照非专利文献3)，对癌症的发生具有抑制效果(例如，参照非专利文献4)，保护宿主不受病毒感染(例如，参照非专利文献5、6)，可能产生抗菌物质(例如，参照非专利文献7)等促进宿主的健康的特性。在双歧杆菌属中，有可以广泛应用于世界范围内的发酵乳制品的制备的菌株。

进而，希望双歧杆菌的质粒应用于益生菌载体、感染性患者的经口疫苗的载体。根据最近的报告已明确在全身给药后，长双歧杆菌积累于低氧的实体瘤中(例如，参照非专利文献8、9)，带有与长双歧杆菌hup启动子相融合的大肠杆菌codA的重组质粒pBLES100-S-eCD在微生物中表达胞嘧啶脱氨酶(例如，参照专利文献1及非专利文献10、11)。由此证明了重组长双歧杆菌对于酶-药物前体疗法有效。不过，虽然在食品、药品和产业中倍受关注，然而主要由于缺少可以以基因传递的有效地复制的系统，因此对它们的遗传的特性几乎不了解。

可以在前述重组质粒pBLES100-S-eCD的构建中使用的pBLES100 是由长双歧杆菌BK51的pTB6和大肠杆菌的pBR322构建的穿梭载体(例如，参照非专利文献12)。所涉及的穿梭载体pBLES100以2.2×10⁴ 个转化子/μgDNA的有效地转化长双歧杆菌，在该细胞中于结构和胞质分离方面趋于稳定(例如，参照非专利文献13)。可是，由于在转染时，存在着带有未修饰DNA的质粒在微生物中被限制性酶切断的可能性，因此在外源基因的克隆中需要更高的转化率。

专利文献1：特开2002-97144号公报

非专利文献1：Scardovi，Bergey’s Manual of SystematicBacteriology vol 2，eds.Sneath等人，pp.1418-1434(1986)

非专利文献2：Mitsuoka，Elsevier Applied Science，pp 69-114(1992)

非专利文献3：Yasui等人，J.Dairy Sci.，74，1187-1195(1991)

非专利文献4：Reddy等人，Cancer Res.，53，3914-3918(1993)

非专利文献5：Duffy等人，Pediatr.Res.，35，690-695(1994)

非专利文献6：Saaverdra等人，Lancet.，344，1046-1049(1994)

非专利文献7：Ibrahim等人，J.Food Prot.，56，713-715(1993)

非专利文献8：Yazawa等人，Cancer Gene Ther.，7，269-274(2000)

非专利文献9：Yazawa等人，Breast Cancer Res.Treat.，66，165-170(2001)

非专利文献10：Nakamura等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，66，2362-2366(2002)

非专利文献11：Fujimori等人，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.，5，200-203(2002)

非专利文献12：Matsumura等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212(1997)

非专利文献13：Matsumura等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212(1997)

发明内容

发明要解决的问题