[发明专利]新的玉米种子切块外植体和玉米离体再生的方法

说明书

本发明中至少一部分是在政府资助-USDAARS批准号5836071193下作出的。美国政府对本发明享有部分权利。

相关申请

本发明要求2004年6月10日提交的、申请号为60/578,496以及2005年1月14日提交的、申请号为60/643,582的美国临时申请的优先权。该两项申请通过引用全部合并于此。

技术领域

本发明提供一种有效而新颖的基于新型种子切块外植体的玉米转化和再生系统。

背景技术

玉米是工业化国家和许多发展中国家最重要的农作物之一。除人对玉米籽粒的食物需求外，玉米的食用还包括干磨和湿磨的加工产品。玉米植株的谷粒及非谷粒部分还广泛用作家畜饲料，主要用作菜牛、奶牛、猪和家禽饲料，所以非常需要种植性状优良的玉米。因此能够对玉米培养进行控制，不仅源于想要阐明植物生长的遗传控制，而且还想开发其商业应用。

单子叶植物的种子包括单子叶，当剥去种皮后种子不会分成两半，而双子叶植物种子的种皮被剥去后则分成两半。单子叶植物中，胚乳养料储存在胚周围，不在单子叶中。双子叶植物中，分开的两半是子叶，或者是养料储存区。初期的子叶通常看起来不像叶片，但随后叶片会从生长的植株上长出来。

玉米成熟籽粒有三个主要部分：果皮、胚乳和胚。参见图1(T.A.Kiesselbach 1999)。果皮位于玉米籽粒的外层，由子房壁发育而成，所以其遗传特性与母本相同。胚乳和胚则代表下一代。胚乳占粒重的85％，是胚萌发后若干天的养料来源。胚位于玉米籽粒的朝向玉米穗上端的较宽侧，在薄的胚乳细胞层下方。胚的大部分组织是盾片部分，为铲状结构，负责将胚乳中储存的营养物质消化并转运给正在萌发的子叶。

Green和Philips(1975)最先报道利用组织培养使玉米植株再生。尽管这一实验取得重大突破，但与建立稳定的细胞培养有关的问题以及接踵而来的与基因型依赖性直接相关的限制仍然存在(Tomes和Swanson，1982，Armstrong，1992)。不过近来Sairam等人(2003)的研究结果表明，芽分生组织的全能细胞能产生大量不依赖于基因型的再生体，而且组织培养的时间明显缩短。

植物全能细胞能通过两种途径进行离体再生：器官发生和体胚发生。在器官发生途径中，全能细胞分化出单极结构，即常与亲本组织相连的芽(Thorpe，1994)。与之相比，当分化出具有封闭独立维管系统、包含根和芽的两极结构时，体胚发生才出现(Thorpe，1994)。

已经发现有很多种不同的外植体都可以发生植株再生。尤其是玉米能通过组织培养再生并能利用各种组织进行转化。前期研究所使用的外植体包括：未成熟胚(Green和Philips，1975)、成熟胚(Wang，1987)、未成熟穗(Songstad等，1992)、胚芽鞘节(Zhong等1992a)、未成熟花(Pareddy和Petolino，1990)、颖(Suprasanna等，1986)、原生质体(Prioli和Sondahl，1989；Rhodes等，1988a)、花药(Buter等1991)、小孢子(Pescitelli等1990)、叶基(Chang，1983)、芽尖(Zhang等，1992；O’Connor-Canchez等，2002)、芽分生组织(Sairam等，2003)和悬浮培养物(Vasil等，1985)。通过器官发生和体胚发生已获得玉米培养再生(Harms等1976；Potrykus等，1977；Rhodes等，1988；Vasil等，1984；Vasil和Vasil，1986；Prioli和Sondhal，1989；Tomes和Smith，1985；Lu等，1982；Novak等，1983；Armstrong和Green，1985)。