[发明专利]产生高度有效抗体的SARS疫苗和方法

说明书

本申请要求2005年5月31日提交的尚未获得美国序列号的申请和2004年6月2日提交的美国序列号60/576,118的申请的优先权，这两个申请的全文内容并入本申请中。

本申请引用了许多出版物。为了更充分地描述本发明所属的技术领域的状态，因而通过引用，将这些出版物的完整内容并入本申请中。

发明背景

严重急性呼吸道综合征(SARS)，一种新出现的感染疾病，由SARS-相关的冠状病毒(SARS-CoV)引起[1-7]，其可能源于一些野生动物[8]。2002/2003年的SARS全球暴发导致数千病例和数百例死亡，严重地威胁全世界的公共健康。在2003年年末和2004年年初，在中国报道了几例新的SARS-CoV感染，其毒株不同于那些造成2002/2003年大流行的SARS-CoV毒株[9]。在台湾、新加坡和中国报道了由于SARS-CoV分离株的意外释放而引起的一些单独的发作(http://www.who.int/csr/sars/en)。这些结果表明，SARS流行病可能在将来的任何时候复发，其通过SARS-CoV由动物到人的传播或通过从实验室样品溢出的病毒导致发生。因此，迫切需要开发有效的和安全的疫苗用于保护受威胁的人群。

目前，在中国，应用灭活SARS-CoV的一种候选疫苗正处于I期临床实验[9，10]。尽管已经表明所述灭活的SARS-CoV有效地保护动物免受SARS-CoV的攻击，但是它在人中的功效尚不清楚。由于病毒体中的一些抗原可以引起不中和而是增强病毒感染的抗体，因此，关于它的安全性存在重要的关注[10]。一些病毒蛋白可以诱导有害的免疫和炎性反应，这是SARS发病机理的潜在的起因和应用免疫抑制剂(例如，类固醇)用于SARS治疗的基本原理[11，12](对这种治疗方案还有很大的争议)。最近，据报道，雪貂的SARS-CoV感染引起轻微的肝脏炎症，并且如果雪貂在病毒攻击之前第一次用基于牛痘病毒的SARS疫苗免疫的话，所述肝脏损伤变得严重得多[13]。

冠状病毒S蛋白负责病毒结合、融合和进入，并且是中和性抗体的主要诱导剂[14-16]。此外，它们在病毒发病机理和毒性中起着重要的作用[17]。SARS-CoV S蛋白对于病毒功能和抗原性也是重要的[18，19]。它是由两个结构域，S1和S2组成的I型跨膜糖蛋白[18](图1)。S1负责病毒与靶细胞上的受体结合。已经证明血管紧张肽转变酶2(ACE2)是SARS-CoV的功能受体[20-23]。位于S1中间区域的片段是受体结合结构域(RBD)[24-26]。S2结构域，其含有推定的融合肽和2个七残基重复序列(HR1和HR2)区域(图1)，负责病毒和靶细胞膜之间的融合。如同衍生于HIV-1 gp41 HR2区域的抗-HIV肽[27，28]，衍生于SARS-CoV S蛋白HR2区域的肽被鉴定为SARS-CoV感染的抑制因子[29]。HR1和HR2区域可以缔合形成六螺旋束结构[29，30]，类似于HIV中gp41[31]和其它冠状病毒，诸如小鼠肝炎冠状病毒(MHV)中的S蛋白[32，33]的融合活性核心结构。这些结果表明，一旦病毒S蛋白上的RBD结合于靶细胞上的ACE2，S2就通过HR1和HR2区域之间的相互作用而改变构象，从而形成融合核心结构并且使得病毒和靶细胞膜紧密接近，导致病毒融合和进入[29]。这表明含有S蛋白上的功能结构域的片段可以用作抗原，用来诱导阻碍病毒结合或融合的抗体。

一些编码SARS-CoV S蛋白的活的减毒的和遗传工程疫苗已经处于临床使用前期的研究中。最近，Nabel和同事[34]报道了编码S蛋白的DNA疫苗候选物诱导T细胞和中和性抗体的反应(中和性抗体滴度在从1∶50到1∶150的范围)，并且保护小鼠免受SARS-CoV攻击，如由呼吸道中减少的SARS-CoV滴度所表明的那样。他们证明所述保护由中和性抗体而不是T细胞依赖型机制而介导。目前，Moss同合作者[35]证明，用包含编码全长SARS-CoV S蛋白的基因的高度减毒修饰的疫苗病毒载体病毒Ankara(MVA)(MVA/S)从鼻内或肌内接种小鼠，可产生具有SARS-CoV中和活性的S特异性抗体(平均中和滴度是1∶284)，并且在从免疫小鼠转移血清后保护小鼠免受SARS-CoV感染。这些数据表明，S蛋白可以诱导保护性的中和性抗体，尽管所述中和性抗体滴度相对较低。