[发明专利]通过PCR检测反刍动物DNA

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2004年1月30日提交的美国临时专利申请No.60/540,757的优先 权，其全部公开内容经引用并入本文。

联邦赞助研究和开发下所作发明权利的声明

不适用。

发明背景

牛海绵样脑病(BSE)或“疯牛”病首先于1986年在大不列颠发现，并传播到欧 洲大陆的国家(例如见Anderson et al.，Nature 382：779-88(1996))。随后的流行病学 研究已经鉴定到牛饲料中的来自感染瘙痒症的绵羊的提取材料是BSE的最可能的最 初原因。BSE的致病因子即朊病毒从提供的动物内脏传播给牛。通过包括提取的牛 肉和骨粉(BMBM)作为动物饲料的成分使BSE进一步传播(例如见Wilesmith et al.， Vet Rec.123：112-3(1988))。BSE现已在英国、欧洲、日本和北美包括加拿大和美国 发现(例如见Normile，Science，303：156-157(2004))。

1997年，作为对BSE传播的流行病学证据的反应，美国食品药品管理局(FDA) 禁止在反刍动物饲料中掺入某些哺乳动物组织(如来源于CNS的组织和肠组织)(例 如见62(108)Federal Register 30935-78(June5，1997))。被认为具有最小风险的产品， 包括提供给人消费的血、血制品、明胶、乳和乳制品、仅来源于猪或马的蛋白质和检 验的肉制品被初步排除在禁令之外。2004年1月，USDA禁止向任何人食品包括可 能进入人食品供应的任何食品中掺入“指定的危险材料”，即30个月和更老牛的颅骨、 脑、三叉神经节、眼、脊柱、脊髓和背根神经节，以及任何年龄牛的扁桃体和小肠的 回肠末端。同月，FDA将禁令扩展到哺乳动物血和血制品、餐馆的来自反刍动物食 物的未吃的肉和其它剩饭。

此外，FDA还建议来自出生或居住于已经出现BSE国家的动物的牛源材料不应 该用于制造FDA管理的将用于人的产品(包括，例如，疫苗)。FDA还推荐在化妆 品制造中应该避免使用高风险牛源蛋白质。

目前，对遵守的估计基于伴随签字和FDA现场访问的信誉制度，其中检查制造 方案和记录保持。目前可用于确定动物饲料中是否存在反刍动物来源蛋白质的验证性 测试是耗时的显微检查方法(Tartaglia et al.，J Food Prot.61(5)：513-518(1998))，该 方法具有大于5％饲料重量的较低检测限，或据报道具有1重量％-5重量％检测限的 免疫学测试(“”Neogen Corp.，Lansing MI)。

自从实行初步禁令，开发提取和鉴定样品(如反刍动物饲料、宠物食品、化妆品、 人食品和营养保健品(nutraceuticals))中禁止添加剂的方法已经受到研究人员的很 多关注。例如，Tartaglia etal.，J.Food Prot.5：513-518(1998)；Wang et al.，Mol.Cell Probes1：1-5(2000)；和Kremar and Rencova，J.Food Prot.1：117-119(2001)描述了提 取和鉴定牛线粒体DNA的方法。Myers etal.，J.Food Prot.4：564-566(2001)比较了核 酸提取方法。然而，这些方法都没有解决饲料中存在干扰DNA检测的抑制剂的问题， 因此引起假阴性结果的高发生率。解决存在PCR抑制剂的商品试剂盒可以获得 (Qiagen Stool Kit，Qiagen Inc，Valencia CA，91355)，但正如以下实施例中所讨论的， 使用这种试剂盒不能消除动物饲料中存在的所有PCR抑制剂。基于酶标记免疫测试 系统(ELISA)的商品筛选试剂盒鉴定牛饲料中的反刍动物污染物(Neogen AgriScreen，Lansing MI，48912)，但该试剂盒依赖于牛饲料中反刍动物蛋白质的存 在，并且不解决饲料中可能存在微量反刍动物蛋白质的问题。

线粒体DNA(mtDNA)的聚合酶链式反应(PCR)的应用已经被研究用于检测 反刍动物饲料中牛污染物的存在(Tartaglia et al.，J.Food Prot.61(5)：513-518(1998))。 然而，该方法不能检测低于0.125重量％的污染物水平，并需要过夜培养步骤。研究 人员还建议使用限制性内切酶分析扩增产物以确保扩增产物特异性的附加步骤。