[发明专利]用滚环扩增法扩增多核苷酸

说明书

交叉参考相关申请

本申请要求发明人Youxiang Wang和Yaping Zong于2003年9月26日提 交的标题为“滚环扩增法扩增多核苷酸序列”的美国专利申请No.60/506,218 的优先权。

发明领域

本发明属于用滚环扩增法(RCA)扩增核酸的领域。

技术背景

在鉴定基因中，获得全长cDNA是关键但常常是困难的任务。构建cDNA 文库的传统方法通常只能产生部分cDNA片断。cDNA末端的快速扩增 (RACE)是为恢复全长编码序列而开发的一项技术，然而，RACE技术仍然 复杂且效率不佳。我们的发明采用RT-RCA技术，其为制备全长cDNA提供 了大为改进和简化的方法。

RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)是用于检测和定量mRNA的高灵敏 技术。该技术由两部分组成：通过逆转录(RT)从RNA合成cDNA，和通过 聚合酶链式反应(PCR)扩增特异性cDNA。我们的发明采用RT-PCR技术， 其提供了用滚环扩增法使扩增和检测mRNA大为改进且更简单的方法。

已建立的核酸扩增方法包括以温度循环为基础的方法例如PCR、LCR和 SPA，及采用等温扩增的方法例如NASBA、RCA、TMA、Qβ复制酶和SDA。 最近，已开发了各种利用RCA的检测和扩增方法，参见例如美国专利 No.5,871，921、5,648,245、5,866,377、5,854,033、6,287,824、6,323，009。

发明概述

本发明提供了利用滚环扩增检测和克隆核酸分子的方法。本发明提供了 利用滚环扩增从复合混合物中扩增、检测和克隆靶核酸分子的方法。本发明 的许多优点可见于各种实施方案中。

在一个实施方案中，本发明提供了用于环化整个靶核酸分子以进行扩增 的方法。此方法能克隆大多数靶核酸的全长序列，如果需要的话，也能扩增 和克隆整个基因组。

在另一个实施方案中，本发明提供利用滚环扩增来扩增和检测靶核酸分子所需 区域的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供利用发夹环以产生用于滚环扩增和检 测的环形多核苷酸的方法，而不是使用锁式探针(padlock probe)或附加模板 以连接形成环形核酸分子的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供通过采用自身引发(self-priming)接着通过 连接而闭合环来环化核酸分子的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供的检测方法，利用靶序列本身产生游 离3’端而引起环化核酸分子的滚环扩增，其中环化的核酸分子可包含用于 基因特异性检测和扩增的全长基因序列，其中不需要加入引物。这使得检测 扩增不需要连接，几乎不需要或不需要外部提供的引物，从而简化了整个反 应。

在另一个实施方案中，本发明提供了基于靶核酸分子与所供给寡核苷酸 或片段之间的相互作用，从所供给的片段或寡核苷酸而不是靶序列产生用于 环化核酸分子滚环扩增的游离3’端的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供多个方法来检测和扩增靶多核苷酸序 列，其包包括用环化寡核苷酸分子进行突变检测。一方面，不必先经PCR扩 增而环化靶核酸分子。靶核酸分子的环化可包括该靶核酸、其互补物的环化 或二者均被环化。如果需要或者希望，可产生或提供游离的3’端。然后用滚 环扩增法扩增该环化的核酸分子。