[发明专利]HER－2变体的纯化

说明书

发明领域

本发明涉及蛋白质的亲和纯化领域。更具体地，本发明涉及金属亲和蛋白质纯化中的改进，尤其是在昆虫细胞中重组生产的带组氨酸标签的或富含组氨酸的蛋白质的纯化。本发明还涉及适于源自蛋白质EGFR(表皮生长因子受体)家族的带组氨酸标签的蛋白质变体，尤其是癌症相关抗原HER-2的具体纯化方案。

另外，本发明涉及能够引起人免疫应答的人HER-2的免疫原性变体，所述免疫应答还靶向天然的人HER-2分子。

发明背景

癌症相关的膜蛋白HER-2是蛋白质EGFR家族的一员。这种特定的蛋白质已经显示可能在某些癌症，特别是乳腺癌和结肠直肠癌的自动特异性免疫治疗中作为免疫原。

本专利申请的受让人先前曾经提交过涉及针对HER-2抗原的主动疫苗接种的专利申请，参见WO 00/20027，特此将其并入本文作为参考。本领域的其它研究现在已经鉴定出对于这些疫苗优选的HER-2变体，但是在蛋白质化学中的一个普遍问题是设计改进的方式来以高纯度获得令人满意的产率的重组蛋白。

固定化金属离子亲和层析(IMAC)首次由Porath(Porath，J.，J.Carlsson，I.Olsson，G Belfrage[1975]Nature 258：598-599)以术语金属螯合层析进行介绍，并且先前已经在几篇文章中得以综述(Porath，J.[1992] ProteinPurification and Expression 3：263：281；以及其中所引用的文章)。IMAC纯化方法是基于加载以软金属离子诸如Cu²⁺和Ni²⁺的螯合性基质的使用。蛋白质表面上的供电子基团，特别是组氨酸的咪唑侧链，能够结合加载金属的非配位位点。通过降低pH或通过用咪唑替代可以使得电子供体基团与金属之间的相互作用可逆。因而，通过可逆的金属复合物/蛋白质相互作用可以纯化具有给电子基团的蛋白质。

1991年，Ford等(Ford，C.，I.Suominen，C.Glatz[1991] ProteinExpression and Purification 2：95-107)描述了将使用IMAC技术(Ni-NTA配体)的蛋白质纯化应用于具有组氨酸残基尾部的重组蛋白质(多组氨酸重组蛋白，“带His标签的蛋白质”)。这种方法利用了这样的事实，即两个或更多组氨酸残基能够协作以形成非常牢固的金属离子复合物。

当组氨酸残基作为“标签(tag)”以各种组合被附着于相关重组蛋白上时，例如包括特异性蛋白酶的识别位点，从而使得his标签随后能够以酶学方法去除，该技术存在许多变化。

在昆虫细胞中蛋白质的表达需要使用各种专门的培养基并且还必然伴有各种源自昆虫细胞的组分对重组蛋白的污染，所述组分未在细菌、真菌和哺乳动物细胞中发现。所以当需要对在昆虫细胞中产生的蛋白质进行纯化时，对于在细菌、真菌和哺乳动物细胞中产生的重组蛋白设计的纯化方案不一定是最佳选择。

因此对于蛋白质纯化的改进有持续性的需要，以便获得源自昆虫细胞中重组生产的药物级别的蛋白质。

发明目的

本发明的目的是提供一种纯化在昆虫细胞中表达的重组EGFR家族蛋白质的改进方法。本发明的另一个目的是提供HER-2蛋白的免疫原性变体，其通过特异性主动(active)免疫治疗的方式可有效用于例如癌症治疗。

发明概述

本发明人设计了一种将EGFR家族蛋白纯化到一定纯度的新方法，该纯度对于药用、特别是用作疫苗试剂是可接受的。

因此，在一个方面，本发明涉及一种纯化EGFR家族衍生蛋白质的方法，所述蛋白质重组生产于昆虫细胞培养物中并且所述蛋白质是适于通过固定化金属亲和层析的手段进行纯化的蛋白质，所述方法包括从所述昆虫细胞培养物中获得含有所述EGFR家族衍生(derived)蛋白质的、基本上不含细胞的样品，并且其后通过下列连续步骤对所述EGFR家族衍生蛋白质进行富集：

-用缓冲液渗滤和交换培养基，

-固定化金属亲和层析(IMAC)，

-大小排阻层析(SEC)，和

-阴离子交换层析(AIE)。

本发明的另一方面涉及HER-2蛋白的一种免疫原性变体，其包含SEQID NO：2，残基17-677所示的氨基酸序列。

附图说明

图1：IMAC的层析图谱。

箭头指示104.1峰。

图2：SEC的层析图谱。

箭头指示单体峰。