[发明专利]HER－2变体的纯化

权利要求书

1.一种纯化EGFR家族衍生蛋白质的方法，所述蛋白质在昆虫细胞培养物中被重组生产并且所述蛋白质是适合于通过固定化金属亲和层析的方式进行纯化的蛋白质，所述方法包括从所述昆虫细胞培养物中获得包含所述EGFR家族衍生蛋白质的、基本不含细胞的样品，其后，通过下列连续步骤对所述EGFR家族衍生蛋白进行富集：

-用缓冲液渗滤和交换培养基，

-固定化金属亲和层析(IMAC)，

-大小排阻层析(SEC)，和

-阴离子交换层析(AIE)。

2.权利要求1的方法，其中所述EGFR家族衍生蛋白质包括促进通过IMAC方式进行纯化的异源氨基酸序列。

3.权利要求2的方法，其中所述异源氨基酸序列富含组氨酸残基。

4.按照权利要求3的方法，其中所述异源氨基酸序列包括SEQ ID NO：2的残基1-14。

5.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述EGFR家族衍生蛋白质包括人EGFR或人HER-2的氨基酸序列的基本部分。

6.按照权利要求5的方法，其中所述基本部分主要衍生自EGFR或HER-2的细胞外部分。

7.按照权利要求5或6的方法，其中所述EGFR家族衍生蛋白质是人HER-2的变体。

8.按照权利要求7的方法，其中人HER-2的变体包括至少一个外源T辅助细胞表位。

9.按照权利要求8的方法，其中人HER-2的变体包括破伤风类毒素表位P2(SEQ ID NO：2的残基269-282)和P30(SEQ ID NO：2的残基649-669)。

10.按照权利要求9的方法，其中人HER-2的变体包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基17-677。

11.按照权利要求10的方法，其中人HER-2的变体的氨基酸序列由SEQID NO：2的残基1-677组成。

12.按照前述权利要求任一项的方法，其中在约2到约25℃，优选地在约3到约8℃的温度下进行渗滤/缓冲液交换的步骤，其中当温度超过10℃时，任选地添加去污剂诸如吐温。

13.按照权利要求12的方法，其中在两轮中进行所述渗滤从而首先浓缩在培养基样品中的大分子化合物并且其后用缓冲液交换培养基。

14.按照权利要求13的方法，其中将所述大分子化合物浓缩约2至25倍。

15.按照权利要求14的方法，其中将所述大分子化合物浓缩约3-5倍。

16.按照权利要求12-15任一项的方法，其中在一个或两个连续步骤中进行缓冲液交换，其中第一个步骤发生在至少6.5和至多7.2的pH下，并且其中第二个任选的步骤发生在至少7.0和最多8.0的pH下。

17.按照权利要求12-16任一项的方法，其中将磷酸盐缓冲液用于缓冲液交换。

18.按照前述权利要求任一项的方法，其中将咪唑、组氨酸或高盐浓度缓冲液加入渗滤的和缓冲液交换的样品，或其中缓冲液交换的样品是基本上没有改变的。

19.按照权利要求18的方法，其中当被加入时，将咪唑加入以达到约0.05到约20mM的浓度。

20.按照前述权利要求任一项的方法，其中将去污剂加入所述渗滤的和缓冲液交换的样品以达到介于约0.05％(v/v)和10％(v/v)之间的、诸如约0.1％(v/v)的浓度，所述去污剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯诸如吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、和吐温85，烷基芳基聚醚醇诸如Triton X100，非离子去污剂，和基于碳水化合物的去污剂诸如辛基糖苷。

21.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述IMAC步骤包括在施加缓冲液交换的样品前，用二价金属离子使层析介质带电。

22.按照权利要求21的方法，其中所述二价金属离子选自由Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，和Fe²⁺组成的组，优选地是Zn²⁺。