[发明专利]哇巴因结合肽或蛋白质及其在治疗高血压中的应用

说明书

一、技术领域

本发明属于多肽或蛋白质的应用，尤其涉及一种哇巴因结合肽或蛋白质及其在治疗高血压中的应用。

二、背景技术

内源性哇巴因(endogenous ouabain，EO)是近年来发现的由肾上腺皮质所分泌的一种新的类固醇激素。以往的流行病学研究显示多种类型的高血压患者血浆EO水平均升高，其中30％～45％的原发性高血压患者明显高于正常血压者，有高血压家族史和临界高血压患者明显高于血压正常的人群。在Milan高血压鼠、DOCA-盐高血压鼠、肾部分切除高血压鼠和自发性高血压鼠(SHR)等动物模型的血浆中也发现EO水平增高。此外，在原发性醛固酮增多症等肾上腺皮质肿瘤、糖尿病、妊娠高血压等继发性高血压患者中也可观察到血浆EO水平明显升高，多元回归分析显示EO的含量与机体的容量状态和血压的长期调节之间存在着密切的联系，强烈提示EO可能参与这些疾病血压异常升高的发生和发展机制。研究表明EO可能通过直接或间接增加外周血管阻力等途径导致血压升高。

高血压的防治是降低其心、脑、肾损害及降低其高致残率和高死亡率之最积极的方法；也与预防冠心病、脑卒中，减少糖、脂质代谢紊乱和糖尿病的发生、发展密切有关。尽管降压药物已有了长足进展，目前临床上用于降压治疗的降压药有6种(利尿剂、转换酶抑制剂、b-受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、a—受体阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂)，但是各类药物有其各自独特的作用和适应症，有效地控制血压是降压治疗的首要目标。本课题组提出了哇巴因结合肽(蛋白质)(Ouabain conjugated peptide & protein，OCP)可通过特异性地与EO结合，拮抗体内高哇巴因水平或封闭EO与钠泵(即Na，K-ATPase)的结合位点，从而减少EO对钠泵的抑制，进而解除高血压的致病因子之一——含量过高的内源性钠泵抑制物对钠泵的抑制作用，达到降压目的。由于哇巴因结合肽(蛋白质)是针对高血压发病学因素的治疗，而不象目前临床上常用的降压药是针对周围靶器官的治疗，故有可能为高血压的治疗开辟新的领域。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种哇巴因结合肽或蛋白质及其在治疗高血压中的应用，哇巴因结合肽或蛋白质能够直接与EO结合或封闭EO与钠泵的结合位点，从而解除高血压的致病因子之一，克服了现有药物在治疗高血压中不能拮抗体内高EO水平在高血压发病中的作用的不足，达到了治疗高血压的目的。

本发明为了实现上述之目的，其采取的技术方案如下：哇巴因结合肽或蛋白质通过“吸咐—洗脱—扩增”的方法，从噬菌体随机肽库中筛选出来的。随机选取的12个噬菌体蓝斑，经扩增、DNA的提取、测序分析，最后由多肽合成仪合成哇巴因结合肽(OCP)。从噬菌体随机肽库中筛选出的氨基酸序列，是一种新发现的氨基酸序列(Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr)，并应用含有此序列的多肽或蛋白，即哇巴因结合肽(蛋白)用于体外生物学实验发现，其具有阻断或拮抗哇巴因抑制钠泵的作用，动物实验表明其可以降低高血压动物模型的血压，而且急性毒性作用小，可用于高血压的治疗。

1、哇巴因结合肽是通过生物淘洗的方法从噬菌体随机肽库中筛选出多肽或蛋白质。筛选哇巴因结合肽的具体方法是：

(1)卵清蛋白—哇巴因(OVA-Ouabain)耦联物的制备：哇巴因加入NalO₄后进行搅拌，加入卵清蛋白，搅拌，加入硼氢化钠形成等体积的饱和(NH₄)₂SO₄溶液，最后溶解沉淀、透析。

(2)生物淘洗：OUA-OVA耦联物包被酶标板后，加入TBST洗液和稀释噬菌体文库，弃去未与噬菌体结合的噬菌体，再加入glycine-HCl收集洗脱液。

(3)吸附实验：OVA包被酶标板后，加入TBST洗液，将已经过淘筛的噬菌体加入酶标板，收集未与噬菌体结合的噬菌体。

(4)快速纯化噬菌体测序模板及测序：噬菌体蓝斑扩增后，对噬菌体测序模板进行纯化、测序及序列分析，最后由多肽合成仪合成哇巴因结合肽。