[发明专利]一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸，属于生物工程技术领域。

背景技术

丙酮酸(Pyruvic acid)是糖代谢中的重要的中间产物。丙酮酸是合成多种氨基酸、维生素及其它有用物质的重要前体，广泛应用于医药、日化、农用化学品、饲料食品等工业。虽然作为一种化工产品，丙酮酸早已实现了工业化生产，但化学法生产的丙酮酸仍沿用酒石酸脱水脱羧法，其主要缺点是丙酮酸产率低、污染严重、且因原料价格昂贵而造成丙酮酸产品价格居高不下，推广应用自然也受到了限制。发酵法生产丙酮酸具有原料成本低、来源广泛、产品纯度高、反应条件温和等许多优点，引起了研究者广泛的兴趣。

《微生物学报》2000，40(5)：528～534；《生物工程学报》2000，16(2)：225～228；《工业微生物》2001，31(2)：10～13；等均有报道，在以前的研究中，本实验室(江南大学教育部工业生物技术重点实验室)经多次改良获得一株光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-IP303，是硫胺素(B₁)、生物素(Bio)、烟酸(NA)和吡哆醇(B₆)的营养缺陷型，即需要这些维生素菌体才能维持生长和积累高水平的丙酮酸，能以氯化铵为唯一氮源。还研究了营养条件、维生素、供氧控制模式等对发酵生产丙酮酸的影响以及Torulopsis glabrata WSH-IP303过量合成丙酮酸的代谢特征。在摇瓶实验(48h)和300L发酵罐(68h)中丙酮酸积累水平分别为38.3g/l和55.8g/l，对葡萄糖转化率分别为0.525g/g和0.553g/g，但发酵液中副产物乙醇的含量较高而丙酮酸产率不高，可能是因为控制丙酮酸到乙醛的代谢支路的丙酮酸脱羧酶(PDC)的酶活比较高而使丙酮酸到乙醛的代谢比较活跃，从而导致丙酮酸的降解和副产物乙醇的产生。

发明内容

本发明的目的是提出一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸

本发明提出一种名称称之为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307，已保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO.M202019，本菌株是以光滑球拟酵母(Torulops glabrata)WSH-IP303为出发菌株，经亚硝基胍(NTG)诱变处理后再在培养基中添加乙酸作为补充碳源，经培养筛选和复筛而得，对其进行维生素营养缺陷型验证，确证仍为NA、B₁、B₆和Bio四种维生素的营养缺陷型。是丙酮酸脱羧酶(PDC)酶活降低的乙酸渗漏缺陷型丙酮酸高产突变株。

光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307菌株的选育方法，其特征是经亚硝基胍(NTG)诱变处理，培养基中添加乙酸作为补充碳源。

出发菌株：光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-IP303，是烟酸(NA)、硫胺素(B₁)、吡哆醇(B₆)和生物素(Bio)四种维生素的营养缺陷型。

培养基：

斜面和种子培养基：葡萄糖30g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，琼脂20g(斜面用)，自来水定容至1L，pH5.5；

发酵培养基：葡萄糖100g，氯化铵7g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 0.8g，KCl 5g，微量元素液5ml，盐酸硫胺素20μg，生物素10μg，烟酸4mg，盐酸吡哆醇100μg，核黄素50μg，CaCO₃ 40g(摇瓶时添加)；乙酸钠添加量为0～10g视实验而定，最佳添加量为6g，自来水定容至1L，pH5.0；

基本培养基(MM)：葡萄糖10g，NH₄Cl 3g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，微量元素液5ml，盐酸硫胺素20μg，生物素10μg，烟酸4mg，盐酸吡哆醇100μg，自来水定容至1L，pH5.0；

筛选培养基(CM)：在MM培养基的基础上添加6g乙酸钠。又称完全培养基。

配制固体平板培养基时添加2％琼脂。