[发明专利]一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸

权利要求书

1.一种光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)，其特征是名称称之为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307(现已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO.M202019)，本菌株是以光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)WSH-IP303为出发菌株，经亚硝基胍(NTG)诱变处理、在培养基中添加乙酸作为补充碳源选育得到，本菌株仍然是烟酸(NA)、硫胺素(B₁)、吡哆醇(B₆)和生物素(Bio)四种维生素的营养缺陷型，是丙酮酸脱羧酶(PDC)酶活降低的乙酸渗漏缺陷型丙酮酸高产突变株。

2.光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307的选育方法，其特征是经亚硝基胍(NTG)诱变处理，在培养基中添加乙酸作为补充碳源，

A出发菌株

出发菌株为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-IP303，是烟酸(NA)、硫胺素(B₁)、吡哆醇(B₆)和生物素(Bio)四种维生素的营养缺陷型，

B培养基

斜面和种子培养基：葡萄糖30g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，琼脂20g(斜面用)，自来水定容至1L，pH5.5；

发酵培养基：葡萄糖100g，氯化铵7g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O0.8g，KCl 5g，微量元素液5ml，盐酸硫胺素20μg，生物素10μg，烟酸4mg，盐酸吡哆醇100μg，核黄素50μg，碳酸钙40g(摇瓶时添加)，乙酸钠添加量为0～10g，自来水定容至1L，pH5.0；

基本培养基(MM)：葡萄糖10g，氯化铵3g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，微量元素液5ml，盐酸硫胺素20μg，生物素10μg，烟酸4mg，盐酸吡哆醇100μg，自来水定容至1L，pH5.0；

筛选培养基(CM)：在MM培养基的基础上添加6g乙酸钠；

配制固体平板培养基时添加2％的琼脂；

微量元素液：CaCl₂·2H₂O 2g，FeSO₄·7H₂O 2g，CuSO₄·5H₂O 0.05g，ZnCl₂ 0.5g，MnCl₂·4H₂O 0.2g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L；

C突变株的诱变和分离筛选

从新鲜斜面上接一环WSH-IP303菌种入种子培养基中(50ml/500ml锥形瓶)，在30℃、200rpm的条件下培养12h后，离心收集细胞，用无菌生理盐水和0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)各洗涤一次，将打散的细胞悬浮于20ml含有10g/L亚硝基胍(NTG)的0.1mol/L的磷酸钾缓冲溶液中，30℃下振荡处理1h，取10ml处理后的菌悬液用0.16mol/L硫代硫酸钠溶液稀释10倍终止反应，离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤后将其接入种子培养基中作中间培养24h，而后经稀释后涂布CM平板，在30℃下培养48h，挑取CM平板上菌落圈大的菌落，对应点种CM和MM平板，挑取CM平板上生长良好而MM平板上不生长或生长得比较微弱的菌落。接种斜面培养基，于30℃培养24h后，每株接一环入发酵培养基，根据丙酮酸产量的高低和其丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的高低来确定复筛用的菌株，复筛前，对复筛用菌株的维生素营养缺陷型遗传标记要进行确认。

3.光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307的用途，其特征是用WSH-LQ307作为发酵法生产丙酮酸的菌株，在发酵培养基中添加0～10g/L的乙酸钠作为补充碳源。

4.如权利要求3所述的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307的用途，其特征是用作发酵法生产丙酮酸的菌株，在发酵培养基中添加6g/L乙酸钠作为补充碳源更佳。