[发明专利]蚕丝心蛋白转基因棉纤维及其基因工程生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及棉纤维改良基因工程，尤其是涉及一种蚕丝心蛋白转基因棉纤维及其基因工程生产方法。

背景技术

棉纤维作为一种天然纤维，一直是纺织业和其相关产业的主要原材料。棉纤维由棉花种皮的表皮细胞分化产生。成熟棉纤维中纤维素含量达90％以上，同时含有一部分蛋白。棉纤维的品质，主要决定于纤维强力、长度、伸长度等性状。这些性状主要受基因型控制，环境因子和栽培对其影响低于20％。随着分子生物学研究的深入和植物转基因技术的逐渐成熟，用基因工程方法改良棉纤维品质，将成为培育优质棉的重要手段。目前，美国、澳大利亚等国都投入大量资金进行棉纤维的分子生物学研究。美国Agrocetus公司的科学家M.E.John博士等克隆了数个棉纤维特异表达的基因(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：5769-5773；John ME，Plant Mol Biol，1996，30：297-306；John ME，Critical Reviews in Biotechnology，1997，17(3)：185-203)，并利用棉纤维特异表达启动子将外源合成PHB的基因转入棉花，使棉花纤维中产生脂肪聚酯复合物-PHB(多羟基丁酸酯)(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：12768-12773)。

角蛋白可分为两类，一类是α-角蛋白，一类是β-角蛋白。蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白丝心蛋白是β-角蛋白。丝心蛋白分子是片层结构，链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。由于这种结构方式使丝纤维具有很高的抗张强度，又有很柔软的特性。

蚕丝由蚕丝心蛋白组成，国外已从蚕中分离到了蚕丝心蛋白基因(Yoshimi，K等，Gene.110(1992)：151-158)。蚕丝心蛋白由两条链组成，一条重链和一条轻链，其中重链350kDa大小，轻链25kDa大小。

将蚕丝心蛋白轻链基因转入棉花，在棉纤维中特异表达，以改进棉纤维的纤维韧性及柔软性等。这是一种新的思路和技术，具有重大的实用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蚕丝心蛋白转基因棉纤维，即应用基因工程途径将蚕丝心蛋白基因转入棉花，使棉纤维中产生蚕丝心蛋白成分，改良棉纤维的韧性、弹性等。

运用本实验室从亚洲棉基因组文库中分离到棉纤维特异表达的启动子；克隆出蚕丝心蛋白基因，并在原核细胞中表达，制备蚕丝心蛋白抗体；接着构建由棉纤维特异启动子驱动蚕丝心蛋白基因的转基因二元载体，转化棉花后，对转基因棉花进行了组织化学染色、PCR等分子验证。现T2代正处于生长期，纤维成熟后进一步应用Western blot验证棉纤维中蚕丝心蛋白的表达；最后对转基因棉花纤维进行显微结构、强力、弹性等品质特征分析，并分析其长度、强度等各种性能。转基因棉花纤维T1代棉纤维已经检测，其强度、弹性等都有增强。本发明技术方案详述于后。

本发明提供一种转蚕丝心蛋白基因棉纤维及其基因工程上产方法，利用棉花转基因技术，在棉纤维中特异表达蚕丝心蛋白基因，能生产出全新的基因工程棉花，使棉纤维产生蚕丝心蛋白成分，使棉纤维强力提高，手感等更好。

本发明蚕丝心蛋白转基因棉纤维及其转基因工程方法及鉴定包括：

1、棉纤维特异表达的GAE6基因的克隆

以亚洲棉DNA为模板进行PCR扩增。所用引物为参阅文献(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：5769-5773)设计的，分别为E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。

PCR产物纯化后，采用TA克隆方法装入pGEM-T载体(购自Promega公司)中，转化XL1-Blue(本实验室保存菌种)，然后对插入片段进行PCR鉴定和酶切鉴定(Yu Xiao-hong，Zhu Yong-qing等，Acta PhytophysiologicaSinica，2000，26(2)：143-147)。DNA序列由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室技术组用Appliedbiosystem373型全自动荧光序列分析仪测定。序列用PCGENE软件系统分析。